總攬
陳魏學(xué)基因系列-單細(xì)胞RNAseq測(cè)序原理 視頻 總結(jié)
- 該方法有兩個(gè)特點(diǎn)：特殊的引物設(shè)計(jì)，采用MMLV作為逆轉(zhuǎn)錄酶
引物設(shè)計(jì)
引物的第一部分-通用序列：PCR擴(kuò)增的引物識(shí)別序列
引物的第二部分
引物的第二部分
引物第三部分-定位結(jié)構(gòu)：非T簡(jiǎn)并堿基V
引物第四部分-簡(jiǎn)并堿基N
- 引物設(shè)計(jì)的第二、三、四部分目的是：使引物正好結(jié)合到mRNA的3'端的polyA尾巴的連接處。保證逆轉(zhuǎn)錄的起始位置是mRNA的3'端序列終止位置。
逆轉(zhuǎn)錄酶
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可在合成的新鏈末端加幾個(gè)不依賴(lài)模版的堿基C
SMARTer II A引物的3'末端是3個(gè)非脫氧的堿基G
SMARTer II A引物的3'末端是3個(gè)非脫氧的堿基G
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SMARTer II A引物引導(dǎo)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶參與以剛合成的cDNA鏈為模版的第二條鏈的合成。
得到雙鏈cDNA，兩端接好人工設(shè)計(jì)的PCR引物序列 - 然后加入“常規(guī)PCR引物”，進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增
- 再 超聲打斷，建庫(kù)，測(cè)序
此法亮點(diǎn)總結(jié)
- 使用定位引物，保證互補(bǔ)鏈的合成是從mRNA的3'最末端配對(duì)處開(kāi)始；同時(shí)保證合成的鏈的下游連接上通用PCR序列；
- MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可在合成的新鏈末端加幾個(gè)不依賴(lài)模版的堿基C，保證了只有那些多帶了幾個(gè)堿基C的合成的第一鏈才能進(jìn)行被作為模版進(jìn)行第二條鏈的合成，保證是雙鏈全長(zhǎng)cDNA;
- 保證PCR擴(kuò)增效率的一致性，通過(guò)在3'和5'端使用統(tǒng)一的引物序列；
SMART測(cè)序效率
