論文信息

Title: Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload-Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation

Journal: Circulation

IF: 23.603

Publish date: 2019

Author: Martini, Elisa; Kunderfranco, Paolo

研究背景

炎癥是心臟疾病的臨床反應(yīng)的重要組成之一，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在心力衰竭的過程中發(fā)揮重要的作用。因此，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)進(jìn)而治療心臟疾病成為了可能，但是心臟免疫細(xì)胞的活性卻知之甚少，并且在壓力超負(fù)載驅(qū)動(dòng)下，心臟免疫細(xì)胞是如何變化的也是未知。

技術(shù)路線

• Pressure-overload transverse aortic constriction(TAC)的C57BL/6J小鼠模型，分別收集1和4周的TAC和Sham模型的CD45+(infiltration of immune cells)細(xì)胞用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；

• 快速分離制備心臟CD45+的protocol以及設(shè)置duplicates增強(qiáng)分析可靠性；

• Seurat的graph based clustering算法聚類；

• Pearson correlation analysis分析聚類效果；

• 使用immune cell gene marker注釋scRNA-seq的CD45+ cells；

• 堆積圖展示免疫細(xì)胞簇豐度的ratio信息；

• fluorescence- activated cell sorting(FACS,熒光激活細(xì)胞分選辦法)驗(yàn)證細(xì)胞簇biomarker；

• DESeq2識(shí)別差異基因；

• GSVA分析獲取不同免疫細(xì)胞簇的pathway富集分?jǐn)?shù)。

研究結(jié)果

1. 心臟組織擁有20類免疫細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇與疾病發(fā)展有密切相關(guān)關(guān)系。其中豐度前三的細(xì)胞群是macrophages/monocytes、B cells和Nature Killer cells。堆積圖顯示，免疫細(xì)胞簇的豐度隨著疾病發(fā)展發(fā)生了變化，這說明心臟毒性免疫反應(yīng)和多種免疫細(xì)胞相關(guān)，最后在整體上表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)。

2. 根據(jù)CCR2的出現(xiàn)+或缺失-定義心臟巨噬細(xì)胞，定居()和游走()macrophage/monocytes。前者負(fù)責(zé)清除細(xì)菌及外來異物，后者負(fù)責(zé)招募促炎(proinflammatory)的macrophage/monocytes。Cluster 3富集，而Cluster 4 5 8則富集。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，cluster 3還特異表達(dá)與免疫相關(guān)的Cd163和Mrc1主要組織相容復(fù)合體II(major histocompatibility complex: MHC)。另外，cluster 4和8可能是骨髓來源的macrophage/monocytes，它們表達(dá)了促炎癥因子oncostatin M (Osm)，該基因的過表達(dá)促進(jìn)心臟器官功能障礙。

3. Sham和TAC組心臟均有大量B cells，根據(jù)四組B cells簇在疾病前后的豐度變化，發(fā)現(xiàn)cluster 2 11收到壓力后激活。

4. 和(更重要)T細(xì)胞均在心衰心臟組織出現(xiàn)，flow cytometry驗(yàn)證了兩類T細(xì)胞的整體豐度類似。unsupervised Reactome signature analysis 揭示 cluster 13 15與T cell receptor signaling pathways顯著相關(guān)。

5. 整合所有免疫細(xì)胞的全局分析揭示 TAC和Sham的差異基因表達(dá)在疾病發(fā)展過程也是動(dòng)態(tài)變化的，第一周和第四周 ll1b等促炎因子基因顯著富集在疾病組，在第四周則出現(xiàn)了Ccr2和Cd68等新的促炎因子基因。最后在綜合所有TAC和Sham分析，仍然發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

學(xué)習(xí)心得

1. 單細(xì)胞注釋：準(zhǔn)確地注釋cell type對(duì)后續(xù)分析至關(guān)重要，文章結(jié)合marker gene 和簇相關(guān)對(duì)簇注釋和合并；

2. 簇內(nèi)進(jìn)行子分類，每個(gè)分類的功能以及marker gene可以進(jìn)一步解析；功能注釋文章用到了unsupervised Reactome signature analysis；

3. 縱向數(shù)據(jù)可通過整體簇豐度變化闡明處理對(duì)基因的影響；

4. GSVA方法對(duì)功能富集分析有較大的幫助；

5. 生物學(xué)知識(shí)要相當(dāng)豐富，文章針對(duì)是心衰的免疫解析，各類免疫細(xì)胞的屬性要有詳細(xì)的了解。TAC后 nature killer cell會(huì)增多。

問題和改進(jìn)

1. 堆積圖面積的變化能夠真正說明免疫細(xì)胞豐度發(fā)生顯著變化呢，并且這種變化是否具有臨床學(xué)的意義呢？文章使用了drastic changes是否合適？

2. 文章提供的數(shù)據(jù)存在不嚴(yán)謹(jǐn)標(biāo)記，TAC 1和4周應(yīng)該是不同的樣本，但它給出的標(biāo)簽是repA 和repB；

Citations

1. Martini, Elisa, et al. "Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload–Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation." Circulation 140.25 (2019): 2089-2107.