本文將介紹骨架載體+目的基因序列合成方法
在合成之前，應該先確定骨架載體backbone+基因序列。其中，骨架載體是根據(jù)自己的實驗需要來決定。
一：目的基因獲取
在進行PCR之前，需要①先針對自己的基因設計對應的引物；②提取與所需表達的基因同源的細胞或組織中的RNA，并經(jīng)過RT程序將其轉化為cDNA；③PCR擴增出所需要的基因片段。
1.設計構建載體所需引物
引物設計部分可參照前文。LncRNA 過表達慢病毒載體引物設計 - 簡書
2.PCR擴增：引物+cDNA樣品+PCR體系（DNA聚合酶、buffer、dNTPs）
PCR擴增的步驟及原理1. 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；2. 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；3. 引物的延伸：DNA模板－引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性、退火、延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。
經(jīng)常用的DNA聚合酶有耐高溫的Taq酶，買的同時會附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些還有(NH4)2SO4)
拿到引物后最好先高速離心，12000rcf, 4°C離心2min，再加DEPC水溶解，置于-20℃保存，可適當分裝。
PCR擴增反應體系及程序設定：
2XPhanta max master mix：25ul
F：1ul（20uM）
R：1ul（20uM）
cDNA：23ul（1ug RNA逆轉錄后，再稀釋10倍）
反應程序：
①95℃ 3min，②95℃ 15s→60℃ 15s→72℃ 1000bp/min(30個循壞，不能多），③72℃ 10min，④4℃ (持續(xù)）。
退火溫度的選取：通常情況下，可以嘗試用兩條引物中較低的Tm值減去5℃來作為退火溫度，但是這種方法有時候會不適用，在不適用的情況下可以考慮做12個退火溫度，這樣試下去，總會找到合適的退火溫度。
3.cDNA純化:跑DNA凝膠+膠回收
配膠：瓊脂糖凝膠濃度選擇：脂糖的濃度，這部分參數(shù)是根據(jù)目的片段的大小選擇的，一般500bp以下選擇1.2%-1.5%（質量體積比）500bp-10kb可以選擇0.8%-1%，分子量再高的話瓊脂糖濃度就再低點。膠的配置：1X?TAE+瓊脂糖粉+Gel Red
本實驗中，有兩種大小的的目的序列，過表達：①6810bp；②3800bp；敲低序列：③15~20bp。因此要配置1.5%的瓊脂糖，跑敲低序列的cDNA；配置0.8%的瓊脂糖，跑過表達的序列。
電泳：樣品中加入DNA loading buffer，上樣，樣品在負極，電泳條件：120V 40min 電泳。注：膠的濃度越低，跑的電壓最好也相應地變低，并增加電泳時間。這樣可以防止條帶跑成一個U型。
膠回收：跑完DNA電泳后，使用手持紫外燈切膠，用膠回收試劑盒回收cDNA。
（2）載體和目標片段的限制性酶切：
①過表達全長：使用XhoI和XbaI對plvx-puro質粒做雙酶切；對上游引物1和下游引物1引出的cDNA以同種酶做雙酶切。
②過表達半長：使用BamHI和XbaI對plvx-puro質粒做雙酶切；使用XhoI和XbaI對上游引物2和下游引物2引出的cDNA做雙酶切；再用BamHI和XhoI對pcDNA3.1-AFAP1-AS1質粒做雙酶切（注：這一步是因為答主已經(jīng)做出來了1-3010片段，前半段的設計和后半段的設計原則一樣，在此不再贅述）。
雙酶切體系：
一共30uL體系，需要按照次序加入，最好不要改變順序！?。?/p>
①無酶ddH2O 或DEPC：補足至30uL
②plasmid：體積=3~5ug/質粒濃度
③10X cutsmart：3uL
④限制性內切酶1：2uL
⑤限制性內切酶2：2uL
注：以上酶切是為了做膠回收，如果僅僅是雙酶切驗證，可將質粒改成1ug，內切酶僅需0.5uL，總體系10uL即可。畢竟內切酶也很貴??！
（3）連接轉化：
①載體：載體濃度在20-100 ng/uL最好，體系內總量50-100 ng即可。如果所選載體多克隆位點上的倆個酶切位點比較近，甚至相鄰，最好分步酶切載體，比雙酶切效果好的多。
②總體積：通用10-15 uL
③載體和插入片段比例：一般是1:3，如果很難連接，比如說平端連接，要適當提高載體濃度，同時加大比例1:10
④大片段相連:越大的片段越難連接，可采用方法a.減小反應體系，以提高反應體系中載體和插入片段的濃度；b.適當增加T4的用量；c.對大片段分成幾個小片段，再依次連接到載體上，兩兩相連。
⑤多片段相連：多片斷的連接最經(jīng)常的做法是順次倆倆連接（目的片斷和載體片斷的連接），采用載體上的多克隆位點，此時應注意酶切位點的順序。
千萬要注意，不能直接把目的片段ABC連一起，而應該依次把目的片段依次克隆到載體上去，否則就會出現(xiàn)下圖中的結果：出現(xiàn)很多條不明確條帶（末端自連導致的）
注意所有片斷兩端的酶，是否存在同尾酶和同裂酶，例如BamHI和Bgl II是同尾酶，Sal I和Xho I 是同尾酶；同尾酶-百度百科，同裂酶-百度百科。
質粒酶切回收大片段與目的基因連接，連接反應在16℃反應過夜。DNA連接體系可根據(jù)本組使用的酶說明書來確認。
取10ul連接產(chǎn)物與50ul 感受態(tài)細菌（對于慢病毒載體，最好選擇stable3菌株，更有利于質粒穩(wěn)定；而對于原核表達的載體，最好選擇Rosetta菌株）混勻后冰浴30min，42℃熱激90s，立即置冰上放置5min,加入預熱至室溫的500ul LB培養(yǎng)基， 37℃恒溫培養(yǎng)60min，吸取 200ul的菌液，用移液器混勻后均勻涂布于含50ug/ml Ampicillin抗性（根據(jù)骨架載體的特征來選，這里用的是pLvx質粒，因此選Amp）的LB平板上， 37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。
（4）挑取克隆提質粒驗證：
挑取5個單菌落接種于含5ml，載體對應抗性的LB培養(yǎng)液中，200rpm，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，再進行雙酶切驗證、測序驗證。
