1. 第一代測(cè)序（Sanger測(cè)序）
關(guān)鍵詞：雙脫氧測(cè)序、末端終止測(cè)序
1.1 正常DNA的合成過程
在模板鏈和引物存在的條件下，核糖體RNA分別將四種脫氧核糖酸(dNTP)運(yùn)輸至引物末端。然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則脫水形成5'-3'磷酸二酯鍵。
1.2 Sanger測(cè)序原理
使用鏈終止法，即向反應(yīng)體系中同時(shí)加入脫氧核糖酸(dNTP)和雙脫氧核糖(ddNTP)。兩者均可隨機(jī)整合到模板鏈上形成DNA，但是ddNTP由于缺少羥基（-OH），在整合到模板鏈條上，反應(yīng)隨機(jī)終止。利用ddNTP的這一特點(diǎn)，結(jié)合檢測(cè)電泳條帶或者利用光源信號(hào)傳導(dǎo)即可獲得序列。
1.3 Sanger測(cè)序優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：
- 方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確率高，測(cè)序片段較長，一次可達(dá)1kb。
缺點(diǎn)：
- 成本高，通量低
2. 第二代測(cè)序（Illumina測(cè)序?yàn)槔?/h1>
關(guān)鍵詞：橋式PCR，可逆末端終止，高通量，邊合成邊測(cè)序
關(guān)鍵詞：橋式PCR，可逆末端終止，高通量，邊合成邊測(cè)序
Illumina公司的Solexa和Hiseq兩個(gè)系列的機(jī)器是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器，為了獲得完整的基因組，通常包括三個(gè)階段：測(cè)序、短序列比對(duì)和序列拼接。
IIIumina測(cè)序數(shù)據(jù)的特點(diǎn)：讀長短、具有一定的錯(cuò)誤率、深度高、reads之間具有pairend關(guān)系
2.1 測(cè)序
根據(jù)測(cè)序的流程大致分為三步，測(cè)序完成得到原始數(shù)據(jù)在進(jìn)入短序列拼接之前還會(huì)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和控制等中間過程。
制備DNA基因組樣本時(shí)，選擇單倍體、樣品的總量和DNA濃度OD需要達(dá)到要求，注意不要降解
2.1.1 第一步：構(gòu)建基因文庫
步驟一：利用超聲波將待測(cè)的DNA樣品打斷成小片段，通常為500bp左右。
步驟二：修復(fù)小片段為平末端，進(jìn)一步在平末端添加A堿基，形成黏性末端。
步驟三：在粘性末端添加adapter接頭、測(cè)序引物、index標(biāo)簽等。
文庫：就是DNA片段的一個(gè)集合，將測(cè)序片段打斷之后就構(gòu)成了一個(gè)文庫，通常片段小于1kb的文庫稱為小片段文庫(pairend)，大于1kb的文庫稱為大片段文庫(matepair)。文庫的大小又被成為insert size，可用于后續(xù)的拼接。
2.1.2 第二步：橋式PCR
步驟一：液體流過流動(dòng)池(Flowcell)之后，單條DNA序列會(huì)被固定到流動(dòng)池上。
步驟二：進(jìn)行多次橋式PCR擴(kuò)增。
步驟三：多余的DNA序列會(huì)被液體沖走，在流動(dòng)池上留下一簇一簇相同的DNA單鏈。
橋式PCR的目的是為了增大信號(hào)源，便于檢測(cè)，其詳細(xì)的原理可以參考：
Seurat_
2.1.3 第三步：測(cè)序
步驟一：向反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP。
步驟二：合成第一個(gè)堿基后，不能正常進(jìn)行后續(xù)反應(yīng).
步驟三：清除剩余未使用的堿基和試劑。
步驟四：激發(fā)堿基熒光并收集信號(hào)。
步驟五：去除第一堿基的阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán)。
步驟六：循環(huán)進(jìn)行步驟一至步驟五。
每條序列需要進(jìn)行兩次測(cè)序，正向引物完成測(cè)序之后，會(huì)被液體沖走，然后利用反向引物進(jìn)行另一端的測(cè)序。
2.1.4 測(cè)序飽和度評(píng)估
-
目的：推測(cè)測(cè)序所需要的最小數(shù)據(jù)量，理論上10倍數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠，但是實(shí)際上還存在其他誤差，因此會(huì)高于這個(gè)數(shù)值。
理論最小值
2.1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控
1. 兩個(gè)指標(biāo)
- 堿基含量分布：測(cè)序后的GC含量要和基因組GC含量相同。
- 堿基質(zhì)量分布：Q20堿基百分比（一般要求在90%以上），Q30堿基百分比（一般要求在85%以上）
Q20指這個(gè)位點(diǎn)的堿基的錯(cuò)誤率為百分之一，Q30為千分之一。
2. 用fastqc可以生成質(zhì)量控制報(bào)告
2.1.6 測(cè)數(shù)數(shù)據(jù)處理——過濾
- 非基因組序列。包括adapter接頭、測(cè)序引物、index標(biāo)簽等。
- N堿基過多的reads。通常N堿基的占比超過read的10%以上會(huì)被去除。
- 低質(zhì)量reads。以Q20為標(biāo)準(zhǔn)，低于一定的Q20比率會(huì)被去除。
- 去除duplication。兩對(duì)完全一致的reads會(huì)去除一對(duì)。
注：
- pairend的reads只要有一條reads不滿足條件，兩條reads都需要去除。
- 在RNA-seq和16s測(cè)序過程中不能去除duplication，否則會(huì)丟失一些豐度信息。
2.2 測(cè)序拓展內(nèi)容
2.2.1 大片段文庫
實(shí)際上無論是大片段文庫或者小片段文庫，都無法完全測(cè)出一條read的全長。例如，Illumina構(gòu)建的小片段文庫為500bp，雙末端測(cè)序一般只會(huì)測(cè)得兩端各150bp左右的長度，中間的200bp是無法測(cè)得的。但是由于最初構(gòu)建文庫時(shí)是隨機(jī)打斷的，第一條read無法測(cè)序到中間的序列，后續(xù)的reads也會(huì)測(cè)得中間的序列。
1. 構(gòu)建大片段文庫的目的：
為了獲得reads之間的物理距離關(guān)系，方便后續(xù)的序列拼接。
2. 大片段文庫的測(cè)序過程：
步驟一： 大片段兩端加入帶生物標(biāo)記的序列進(jìn)行環(huán)化處理。
步驟二：后續(xù)步驟和小片段文庫測(cè)序類似
3. pairend和matepair文庫區(qū)別
測(cè)序的reads方向不一致，pairend相向，matepair相反。
2.2.2 測(cè)序注意事項(xiàng)
不能一次性測(cè)序完整基因組，因?yàn)镻CR技術(shù)限制了讀長，同時(shí)從樣品中提取出的基因組很難保證完整性。
GC偏差會(huì)影響PCR，正常GC含量為35%~65%。
選擇的文庫大小和reads讀長要協(xié)調(diào)；在Denove拼接過程中，先使用小片段文庫，逐漸增大文庫；
二代測(cè)序不能一直測(cè)下去，因?yàn)殡S著反應(yīng)進(jìn)行，后續(xù)的反應(yīng)條件發(fā)生了變化；同時(shí)，在cluster過程中，由于堿基反應(yīng)的步調(diào)不一致現(xiàn)象(phasing)，會(huì)導(dǎo)致誤差。
2.3 短序列比對(duì)
短序列比對(duì)就是將過濾好的reads重新定位到基因組上，這個(gè)過程也叫回貼(mapping)。
2.3.1 短序列比對(duì)的四種情況
2.3.2 短序列比對(duì)的應(yīng)用
1. 與自身基因組比對(duì)
1.1計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)覆蓋深度
1.2 計(jì)算參考序列覆蓋比率
2. 與參考基因組比對(duì)
2.1 RNA測(cè)序計(jì)算基因表達(dá)量
2.2 變異檢測(cè)
2.3 宏基因組測(cè)序計(jì)算不同生物的豐度
2.3.3 基因差異表達(dá)計(jì)算
1. 基因結(jié)構(gòu)
2. 成熟mRNA
3. 基因表達(dá)差異的指標(biāo)
3.1 FoldChange，不同樣本中同一個(gè)基因表達(dá)水平的變化倍數(shù)，即RPKM值的差值，差值越大，變化越大。
3.2 FDR矯正，F(xiàn)DR越小，差異約顯著。
注：
- 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于啟動(dòng)區(qū)與5‘UTR非翻譯區(qū)之間，翻譯起始位點(diǎn)位于 CDS起始密碼子。
- RPKM值消除了基因長度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異（可變剪切用FPKM值）。
2.3.4 變異檢測(cè)
????單堿基的變換：轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入
2.3.5 物種組成和豐度計(jì)算
步驟一：16s序列長度為1.5kb左右，不能一次性測(cè)通，采用雙末端測(cè)序得到不同的reads，質(zhì)控過濾，不能去除duplication。
步驟二：將兩條reads拼接成tags
步驟三：將不同的tags聚類成不同的OUT
步驟四：與16s數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置閾值。
2.4 序列拼接
????又稱為de nove拼接，將測(cè)序得到的reads輸入給拼接軟件，利用reads間的overlap進(jìn)行拼接。
????目前序列拼接的算法有兩種：一種是Overlap-Layout-Conesensus(常用于sanger等長片段拼接)，另一種是De bruijn graph(常用于illumina等短序列拼接)。但是本質(zhì)都是基于序列間的overlap來進(jìn)行拼接。
常見名詞：
- reads，測(cè)序直接得到的片段
- pairend和matepair，文庫大小
- insertsize，物理長度
- kmer，將reads切割成更小的固定片段
- contig，通過kmer之間的overlap連接成更長的片段（有時(shí)也指reads連接成contig）
- scaffold，contigs之間通過pairend關(guān)系，連接成更長的片段
2.4.1 kmer值估計(jì)基因組大小
1. kmer定義
取reads的kmer就取兩次，正向取一次，反向互補(bǔ)會(huì)再取一次。
2. 利用kmer的分布圖估計(jì)基因組大小
2.4.2 基于德布萊英圖(De bruijn graph)算法拼接
1. 構(gòu)圖（gregraph）
即切kmer（13-127之間的奇數(shù)），去除頻數(shù)為1的kmer（kmer頻數(shù)為1，那么相應(yīng)的reads也只測(cè)得一次，這在高通量測(cè)序當(dāng)中是幾乎不可能的）
2. 構(gòu)建contig
利用不同kmer大小的片段間的overlap形成一個(gè)德布萊英圖，然后簡(jiǎn)化該圖，理論上該圖只有一個(gè)頭部和尾部，但是由于測(cè)序過程中，存在重復(fù)區(qū)域等情況。實(shí)際形成的德布萊英圖會(huì)有很多的頭部和尾部。然后去除較短的分支，就形成了很多的contigs，contigs彼此之間沒有overlap關(guān)系。
3. 構(gòu)建scaffold
-
構(gòu)建過程
通過reads之間的paired關(guān)系，將contig連接成更長的序列，就是scaffold。首先將測(cè)序的reads重新定位到contigs上，然后記錄下pairend的比對(duì)情況。落在同一contig用于計(jì)算insertsize，落在不同contig用于構(gòu)建scaffold。（例如：reads1比對(duì)到contig1的末尾150bp，reads2比對(duì)到contig2的起始150bp。而reads1和reads2之間的insetsize是500，那么contig1和contig2連接形成scaffold的過程中會(huì)有200bp的N堿基存在）
比對(duì)過程中要注意reads的方向問題
????通常比對(duì)上不同contig的pairend要有三對(duì)以上才能確定物理位置關(guān)系，進(jìn)一步連接成scaffold。
- 當(dāng)基因組中重復(fù)序列過多時(shí)，pairend關(guān)系可能不足以確定contig之間的位置關(guān)系，此時(shí)需要用到matepair文庫。
- 拼接的策略：首先用小片段文庫，然后逐漸加入大片段文庫。但是一般情況下很難得到一條完整的基因組序列。
-
特點(diǎn)
①scaffolds序列的方向并不一致，有的來自正義鏈，有的來自反義鏈（但都是5‘-3’）。
②scaffolds之間并沒有位置關(guān)系，只是有的軟件會(huì)按照大小順序輸出。
③scaffold里面可能存在N堿基，但是contig序列沒有N堿基。
4. 補(bǔ)洞
基因組上的洞，即gaps，是由N堿基構(gòu)成的。在由contigs形成scaffold過程中會(huì)產(chǎn)生gaps。
有關(guān)gap：
- N堿基數(shù)目由insertsize確定，但是不完全準(zhǔn)確
- N堿基來自基因組復(fù)雜區(qū)域（重復(fù)，GC異常等區(qū)域），不容易拼接出來。
- 補(bǔ)洞策略
①利用sanger測(cè)序長片段補(bǔ)洞
②若N區(qū)域過大(超過2k)，可以用pacbio測(cè)序長片短補(bǔ)洞
③利用pairend關(guān)系補(bǔ)洞
3. 第三代測(cè)序
主要包括三種測(cè)序技術(shù)，分別利用了光信號(hào)、電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換
3.1 PacBio公司的SMAT
1. 原理概述
應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序的思想，以SMRT芯片為測(cè)序載體，DNA聚合酶和模板結(jié)合，用4色熒光標(biāo)記 4 種堿基。在堿基配對(duì)階段，不同堿基的加入，會(huì)發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。保持酶活性，區(qū)別反應(yīng)信號(hào)與周圍游離堿基熒光背景是關(guān)鍵技術(shù)。
2. 特點(diǎn)
讀長長，測(cè)序速度快，測(cè)序錯(cuò)誤率較高，達(dá)到15%，但是出錯(cuò)是隨機(jī)的，可以通過多次測(cè)序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)。
3.2 Oxford公司的Nanopore
1. 原理概述
根據(jù)堿基所影響的電流變化幅度的不同，設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí)，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度，靈敏的電子設(shè)備檢測(cè)到這些變化從而鑒定所通過的堿基，是一種基于電信號(hào)而不是光信號(hào)的測(cè)序技術(shù)。
2. 特點(diǎn)
讀長很長，達(dá)到幾十kb，甚至100kb，錯(cuò)誤率在1%到4%之間，且是隨機(jī)錯(cuò)誤，通量較高，能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶。
3.3 Ion Torrent6
1. 原理概述
該技術(shù)使用一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片（一個(gè)小孔就是一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池）。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時(shí)，會(huì)釋放出一個(gè)氫離子，從而引起反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器將感受到氫離子信號(hào)直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，從而讀出DNA序列。
2. 特點(diǎn)
成本相對(duì)較低，操作簡(jiǎn)單，速度較快，但是通量不高。
4. 總結(jié)
