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“每逢佳節(jié)胖三斤”，又到了和渾身的肉肉斗智斗勇的時候。今天，我們就來仔細(xì)的研究下自己的肉肉吧。
摘要：阻斷β-腎上腺素能受體（β-AR）信號通路后，寒冷刺激依然能夠誘導(dǎo)米色脂肪生成，且這種米色脂肪表現(xiàn)出較強(qiáng)的糖氧化能力。
我們知道，哺乳動物的脂肪組織主要分為兩種，白色脂肪組織（white adipose tissue, WAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue, BAT），前者用于儲存能量，后者用于產(chǎn)熱耗能。近年來發(fā)現(xiàn)，在寒冷刺激下或激活β-腎上腺素能受體（β-adrenergic receptor, β-AR），白色脂肪可發(fā)生棕色樣變，形成可以產(chǎn)熱耗能的米色脂肪（beige fat），因此誘導(dǎo)米色脂肪產(chǎn)生在治療肥胖、糖尿病等代謝性疾病方面有極好的應(yīng)用前景。然而由于β-AR激動劑可引起高血壓、增加心血管疾病風(fēng)險，嚴(yán)重限制了β-AR激動劑作為抗肥胖藥物的應(yīng)用。那么能不能繞過β-AR信號通路促進(jìn)米色脂肪產(chǎn)生呢？
2018年12月19日美國加州大學(xué)舊金山分校糖尿病中心的Shingo Kajimura教授團(tuán)隊在Nature雜志上發(fā)表了題為Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state的研究成果，發(fā)現(xiàn)阻斷β-腎上腺素能受體信號通路后，小鼠腹股溝WAT出現(xiàn)生肌細(xì)胞，寒冷刺激則可誘導(dǎo)此生肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一種糖酵解能力明顯增強(qiáng)的米色脂肪。這一發(fā)現(xiàn)讓胖子們看到了希望，下面我們一起學(xué)習(xí)一下吧。只想了解大概套路的同學(xué)可直接滑到最后，查看文末的學(xué)霸筆記。
背景介紹
脂肪的分類
如下圖所示，哺乳動物的脂肪組織可分為三種，白色脂肪組織（WAT）就是我們通?？吹降陌谆ɑǖ姆嗜?，分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪。白色脂肪細(xì)胞大而飽滿，細(xì)胞中央有一大脂滴，線粒體含量較少，主要用于儲存能量。棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)則散在分布許多小脂滴，含有豐富的UCP1+線粒體，可以產(chǎn)熱。在寒冷或β-AR激動劑刺激下，白色脂肪組織可發(fā)生棕色化，生成米色脂肪。米色脂肪細(xì)胞的特征與棕色脂肪細(xì)胞相似，也含有大量的UCP1+線粒體，可以產(chǎn)熱，然而其主要散落于白色脂肪中。
脂肪組織的血管基質(zhì)部分
脂肪組織中的血管基質(zhì)部分（stromal vascular fraction, SVF)是脂肪組織經(jīng)膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細(xì)胞后得到的。SVF含有豐富的、具有多向分化潛能的脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ASC)，因此可塑性極強(qiáng)。WAT來源的SVFc可在特定的環(huán)境下分化為成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞和心肌纖維細(xì)胞，相比之下，BAT來源的SVF可塑性較弱。小鼠腹股溝WAT是可塑性最強(qiáng)的脂肪組織，可作為提取干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療的取材部位。
CreERT2和Rosa26-mTmG小鼠
CreERT2小鼠是一類表達(dá)雌激素受體（estrogen receptor，ER）的配體結(jié)合區(qū)突變體（ERT）與Cre重組酶的融合蛋白的小鼠。CreERT2在無Tamoxifen誘導(dǎo)的情況下，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)；當(dāng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，Tamoxifen的代謝產(chǎn)物4-OHT（雌激素類似物）與ERT結(jié)合，可使CreERT2進(jìn)核發(fā)揮Cre重組酶活性。利用不同的啟動子，可以在不同組織或細(xì)胞中特異性調(diào)控表達(dá)Cre。
Rosa26-mTmG： mTmG是一種紅綠熒光報告系統(tǒng)，正常情況下在細(xì)胞膜表達(dá)紅色Tomato熒光，在有Cre重組酶的情況下，會變成綠色GFP熒光。Rosa26為外源基因插入位點。Rosa26-mTmG小鼠是一種常用的報告小鼠，通過紅綠熒光直觀顯示小鼠是否發(fā)生了Cre重組。
方法與結(jié)果
1 阻斷β-AR促進(jìn)WAT生成生肌細(xì)胞
前文中有提到，WAT在寒冷或β-AR激動劑刺激下可生成米色脂肪細(xì)胞，產(chǎn)熱耗能，因此β-AR可作為肥胖和糖尿病的潛在治療靶點。然而因為β-AR激動劑可引起高血壓，嚴(yán)重限制了其使用，因此作者想探究阻斷β-AR信號通路后，機(jī)體是否存在生成米色脂肪的代償通路。
作者首先構(gòu)建了一種β-less小鼠模型，即把三種β-AR全部敲除，然后將其暴露于15℃環(huán)境中（小鼠正常飼養(yǎng)溫度為18~28℃），發(fā)現(xiàn)β-less鼠腹股溝WAT仍有米色脂肪組織生成，那么在缺乏β-ARs的條件下，小鼠是通過什么途徑生成米色脂肪的呢？
作者將β-less鼠和WT對照鼠的腹股溝WAT進(jìn)行RNA-seq和聚類分析，確認(rèn)了三個gene set：gene setⅠ是WT鼠和β-less鼠暴露于寒冷后基因發(fā)生同樣變化的基因集，主要包括棕色脂肪產(chǎn)熱、呼吸鏈電子傳遞和脂肪酸代謝相關(guān)基因，冷刺激后，其表達(dá)水平均升高；gene set Ⅱ和Ⅲ是僅在β-less鼠中發(fā)生明顯變化的基因，GO分析顯示其主要為線粒體翻譯、三羧酸循環(huán)、橫紋肌收縮和葡萄糖代謝。WAT中為什么會有橫紋肌收縮相關(guān)基因表達(dá)，而且冷刺激后發(fā)生明顯變化呢？
作者檢測了β-lesss鼠肩胛骨棕色脂肪組織（iBAT）、腹股溝WAT及骨骼肌組織中骨骼肌相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)室溫下β-less鼠WAT的骨骼肌相關(guān)基因，如Myh1、Myl1等，表達(dá)明顯升高，冷刺激后，表達(dá)明顯降低，iBAT和骨骼肌組織中的骨骼肌相關(guān)基因則一直無明顯變化。
為了排除β-less鼠WAT中骨骼肌相關(guān)基因高表達(dá)是由于β-AR敲除的組成性缺陷所致，作者用β- blocker阻斷WT小鼠的β-AR信號通路，觀察到同樣的結(jié)果。同時作者觀察到β-blocker鼠WAT的部分基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MyoD蛋白，而vehicle處理組沒有表達(dá)。來自β-blocker鼠的基質(zhì)細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可融合成表達(dá)MHC的多核肌管，并在分化的第6天發(fā)生收縮，vehicle處理鼠則沒有觀察到MHC+肌管。
作者用Myod1-CreERT2;Rosa26-mTmG報告小鼠追蹤β-blocker鼠腹股溝WAT的MyoD+細(xì)胞是如何產(chǎn)生的，發(fā)現(xiàn)阻斷β-AR后，腹股溝WAT的SVF先出現(xiàn)單核的MyoD+細(xì)胞，然后融合形成MyoD+肌管。
2 發(fā)現(xiàn)糖酵解米色脂肪
上述結(jié)果顯示，阻斷β-AR后小鼠腹股溝WAT出現(xiàn)MyoD1+細(xì)胞。一般情況下，MyoD1+譜系細(xì)胞不會分化成白色或棕色脂肪細(xì)胞，那么這些MyoD1+細(xì)胞是干嘛用的呢？
作者用Myod1-CreERT2；Rosa26-mTmG小鼠進(jìn)行了如下圖a所示的實驗，發(fā)現(xiàn)冷刺激5天后β-blocker組和vehicle組小鼠腹股溝WAT產(chǎn)生大量的UCP1+米色脂肪細(xì)胞。且作者發(fā)現(xiàn)β-blocker組小鼠的部分UCP1+米色脂肪細(xì)胞來源于Myod1+譜系，而vehicle組小鼠沒有Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞。因為β-blocker組的GFP+米色脂肪細(xì)胞不表達(dá)MyoD蛋白，但又起源于Myod1+前體細(xì)胞，所以作者將其命名為Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞。Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞占β-blocker組UCP1+米色脂肪細(xì)胞的14.8%±2.5%左右。β-blocker小鼠的iBAT和附睪WAT則未發(fā)現(xiàn)Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞。
有意思的是，即使不用β-blocker預(yù)處理，將老鼠暴露于6℃ 2周，也可誘導(dǎo)Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)生。然而用β3-AR激動劑處理老鼠2周，卻沒有Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，說明Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)生不依賴于β3-AR信號通路。
以上說明小鼠腹股溝WAT存在表達(dá)Myod1的獨(dú)特前體細(xì)胞，當(dāng)阻斷β-AR通路后，冷刺激可誘導(dǎo)其分化為米色脂肪細(xì)胞。
這種Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞與普通米色脂肪細(xì)胞有什么不同嗎？
作者分離β-blocker小鼠腹股溝WAT的 Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞、非Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示Myod1+來源的GFP+脂肪細(xì)胞大量表達(dá)棕色或米色脂肪細(xì)胞標(biāo)志物，如Ucp1和Kcnk3，而不表達(dá)骨骼肌細(xì)胞特異性的基因Myh1和Myog，因此認(rèn)定Myod1+來源的GFP+脂肪細(xì)胞為米色脂肪細(xì)胞。主成分分析（PCA）顯示Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)出與非Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞不同的分子特征。與非Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞相比，Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞高表達(dá)糖酵解、糖代謝相關(guān)基因，如Eno1和Pkm2。這些糖酵解相關(guān)基因在冷刺激的β-less鼠的腹股溝WAT中也高表達(dá)。
轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果提示Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞可能糖代謝能力增強(qiáng)。與此一致的是，作者發(fā)現(xiàn)Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞大量表達(dá)糖酵解細(xì)胞的標(biāo)志物烯醇酶1（enolase 1, ENO1），而且與非Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞相比，Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞糖氧化、細(xì)胞外酸化速率（extracellular acidification rate, ECAR）明顯增強(qiáng)，而脂肪酸代謝和耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）無明顯差別。
以上提示阻斷β-AR后，冷刺激促進(jìn)小鼠腹股溝WAT生成一種新型米色脂肪細(xì)胞，這種細(xì)胞的糖代謝能力明顯增強(qiáng)，因此作者將其命名為糖酵解米色脂肪細(xì)胞（glycolytic beige fat, g-beige fat）。
3 糖酵解米色脂肪前體細(xì)胞的特征
前面證明小鼠腹股溝WAT存在表達(dá)Myod1的獨(dú)特前體細(xì)胞，那么這種獨(dú)特的前體細(xì)胞是怎么來的呢？
會不會是既往存在的MyoD+前體細(xì)胞增殖的結(jié)果？作者用BrdU增殖實驗檢測β-blocker小鼠室溫下MyoD+前體細(xì)胞的BrdU攝入速率，未發(fā)現(xiàn)其攝入BrdU，說明其未發(fā)生細(xì)胞增殖。
Pax7是參與骨骼肌生長和分化的一個重要基因，然而免疫熒光顯示MyoD+前體細(xì)胞不表達(dá)Pax7，說明其不是Pax7譜系分化的結(jié)果。
轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示，其分子特征也不同于成肌細(xì)胞和成脂成纖維前體細(xì)胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）。
然而GFP+前體細(xì)胞表達(dá)Pdgfra, Cd34和Cd29，這些都是脂肪前體細(xì)胞的標(biāo)志物，作者就猜想PDGFRα+CD34+CD29+脂肪前體細(xì)胞會不會表達(dá)MyoD？作者構(gòu)建了Pdgfra-CreERT報告小鼠，發(fā)現(xiàn)β-blocker處理后，小鼠腹股溝WAT的10.4%±0.8%的GFP+CD34+CD29+脂肪前體細(xì)胞表達(dá)MyoD蛋白，說明MyoD+細(xì)胞可能來源于PDGFRα+CD34+CD29+脂肪前體細(xì)胞。
為了確認(rèn)MyoD+前體細(xì)胞的上游信號通路，作者對其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行IPA（Ingenuity pathway analysis）分析，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）。這與MyoD+前體細(xì)胞大量表達(dá)Smad5和Bmpr1b（一個BMP受體）一致。
因為BMP7是一個公認(rèn)的可以促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)生的因子，作者便檢測BMP7能否促進(jìn)MyoD+前體細(xì)胞生成米色脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示rBMP7預(yù)處理的MyoD+前體細(xì)胞可以生成包含大量脂滴的脂肪細(xì)胞，而未加rBMP7預(yù)處理的MyoD+前體細(xì)胞則分化成肌管。
4 GABPα控制糖酵解米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育
上面探究了糖酵解米色脂肪前體細(xì)胞的起源，那么糖酵解米色脂肪前體細(xì)胞又是如何分化為米色脂肪的呢？
作者對Myod1+來源的米色脂肪細(xì)胞和β-less鼠冷刺激后生成的米色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行HOMER（hypergeometric optimization of motif enrichment）分析，發(fā)現(xiàn)兩者都明顯富集GABPα(GA-binding protein α)、ERRα(oestrogen-related receptor α)和ERRγ(oestrogen-related receptor γ)結(jié)構(gòu)域。作者在C2C12生肌細(xì)胞中過表達(dá)上述每個因子，看哪個轉(zhuǎn)錄因子能誘導(dǎo)MyoD+前體細(xì)胞分化為米色脂肪細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GABPα的細(xì)胞最有效地分化為脂肪細(xì)胞，且其分化效率可與過表達(dá)PRDM16（控制棕色脂肪生成的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）的細(xì)胞媲美。與產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞相似，過表達(dá)GABPα的脂肪細(xì)胞在毛喉素刺激下顯著高表達(dá)產(chǎn)熱基因，如Ucp1和Pgc1a。此外，過表達(dá)GABPα的細(xì)胞高表達(dá)ENO1，PPARγ和UCP1，而Myod1基因的表達(dá)降低。在功能水平上，與對照組相比，過表達(dá)GABPα的細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的葡萄糖攝入和氧化及ECAR，而脂肪酸代謝和OCR無明顯差異。
以上提示GABPα促進(jìn)MyoD+前體細(xì)胞分化為糖酵解米色脂肪細(xì)胞，為使該結(jié)論更可信，作者又敲除GABPα進(jìn)行反證。
敲低GABPα后，MyoD+前體細(xì)胞分化為糖酵解米色脂肪細(xì)胞的能力嚴(yán)重受損，脂肪細(xì)胞相關(guān)基因，如Ucp1, Adipoq和Fabp4的表達(dá)明顯下降，而生肌相關(guān)基因，如Myh1和Myod1的表達(dá)明顯增加。功能水平上，敲低GABPα的細(xì)胞的ECAR和OCR水平較對照組也明顯下降。
接下來作者在體內(nèi)驗證GABPα對糖酵解米色脂肪細(xì)胞分化的作用。作者構(gòu)建Myod1+細(xì)胞特異性地敲除GABPα的報告老鼠（GabpaMyod1-KO, Myod1-CreERT2; Gabpaflox/flox; Rosa26-mTmG），β-blocker預(yù)處理和冷刺激后，對照組可正常形成GFP+UCP1+的糖酵解米色脂肪細(xì)胞，而敲除GABPα的老鼠只觀察到GFP-UCP1+的米色脂肪細(xì)胞，未觀察到GFP+UCP1+的糖酵解米色脂肪細(xì)胞。
以上有力地證明GABPα對于糖酵解米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育是必需的。
5 糖酵解米色脂肪在代謝中的作用
前面證明糖酵解米色脂肪不同于一般的米色脂肪，其糖代謝能力明顯增強(qiáng)，那么其在代謝中有什么作用呢？
作者構(gòu)建了糖酵解米色脂肪缺陷的老鼠模型，即Myod1-CreERT2;Rosa26-DTR鼠（Myod1-DTR+），該鼠可通過給予白喉毒素特異性地敲除Myod1+來源的細(xì)胞。作者將Myod1-DTR+鼠和同窩的對照鼠用β-blocker預(yù)處理后暴露于15℃環(huán)境中，兩組老鼠均生成糖酵解米色脂肪細(xì)胞。然而用白喉毒素處理后，Myod1-DTR+鼠的糖酵解米色脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯減少，腹股溝WAT的葡萄糖攝入量、OCR和ECAR均明顯降低。
考慮到白喉毒素可能會影響肌肉的功能，作者又構(gòu)建了另一種糖酵解米色脂肪缺陷的老鼠模型，即在Myod1+來源的細(xì)胞中敲除PPARγ（PpargMyod1-KO）。與Myod1-DTR+鼠的結(jié)果一致，PpargMyod1-KO鼠腹股溝WAT的ECAR和OCR水平也明顯降低。這些數(shù)據(jù)說明寒冷刺激下，糖酵解米色脂肪細(xì)胞有助于小鼠腹股溝WAT攝入葡萄糖和產(chǎn)熱。
接下來作者檢測糖酵解米色脂肪在適應(yīng)性產(chǎn)熱和全身糖穩(wěn)態(tài)中的作用。
沒有用β-blocker預(yù)處理的WT小鼠用急性β-blocker處理后置于10℃，因為急性β-blocker阻斷了iBAT的生成，沒有用β-blocker預(yù)處理，也沒有糖酵解米色脂肪生成，小鼠很快發(fā)生了低體溫癥，而β-blocker預(yù)處理過的小鼠再用急性β-blocker處理后暴露于10℃，可在10℃維持核心體溫4h，提示β-blocker預(yù)處理過的小鼠可能依靠糖酵解米色脂肪產(chǎn)熱。而糖酵解脂肪缺陷的小鼠PpargMyod1-KO，用β-blocker預(yù)處理后置于15℃，其核心體溫和全身氧耗略低于對照組，暴露于10℃則很快發(fā)生嚴(yán)重的低體溫癥，進(jìn)一步證明阻斷β-blocker后小鼠主要依靠糖酵解米色脂肪產(chǎn)熱。
另外，跟體重匹配的對照小鼠相比，GTT實驗顯示PpargMyod1-KO鼠有出現(xiàn)葡萄糖不耐受現(xiàn)象。
綜上說明，糖酵解米色脂肪對于阻斷β-AR后寒冷誘導(dǎo)的小鼠的適應(yīng)性產(chǎn)熱及全身的葡萄糖穩(wěn)態(tài)是必需的。
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套路分析
直接看下面的文章大綱吧。值得注意的是，這篇文章中的老鼠一會兒暴露于寒冷中，一會兒處于室溫，容易混淆。記住文章的主線是，阻斷β-AR后讓老鼠在室溫待幾天，使其產(chǎn)生MyoD+生肌細(xì)胞，然后將其暴露于寒冷中，MyoD+生肌細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒饽芰υ鰪?qiáng)的糖酵解米色脂肪細(xì)胞。
閃光點與不足
米色脂肪的生成一般是通過β-AR通路介導(dǎo)的，這篇文章的閃光之處在于，它發(fā)現(xiàn)敲除β-AR后，老鼠依然能夠生成米色脂肪，而且是一種在發(fā)育起源、代謝能力方面都與傳統(tǒng)的米色脂肪不同的新型米色脂肪。
不足之處是，阻斷β-AR后，WAT的MyoD+細(xì)胞是如何形成的沒有探究清楚。
啟發(fā)與思考
這篇文章提示β-AR介導(dǎo)的經(jīng)典米色脂肪生成通路可能還存在不依賴β-AR的補(bǔ)充通路，然而這個補(bǔ)充通路平時是否存在，除了阻斷β-AR，還可以在什么條件下激活等問題都還值得我們進(jìn)一步探索。
