復(fù)蘇
細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或-80℃的細(xì)胞解凍，恢復(fù)其生長的過程。操作原則：快！慢凍速融里的速融就是指細(xì)胞復(fù)蘇過程。
步驟：
1、 準(zhǔn)備工作：預(yù)熱完全培養(yǎng)基。多少℃培養(yǎng)的細(xì)胞就預(yù)熱到多少℃
在生物安全柜/超凈工作臺中，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿，并在其中添加足量預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。
如果需要離心去除凍存細(xì)胞中的凍存液，此時也可以準(zhǔn)備好 15ml 離心管，在管中添加1-2ml 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。
2、 解凍細(xì)胞。
做法有 2 種選擇：
(1)從-80℃或液氮中取出凍存的細(xì)胞，迅速入 37℃水浴，輕搖解凍。凍存管口保持在水面上，以免水浴鍋中的水進(jìn)入管中。
如果凍存細(xì)胞的地方離細(xì)胞房水浴鍋較遠(yuǎn)，可以準(zhǔn)備一個干凈的燒杯，燒杯中裝 37℃ 水，帶著燒杯去取細(xì)胞以實現(xiàn)迅速入水浴，或者路上利用體溫手搓凍存管到達(dá)水浴 時如未充分解凍再投入水浴繼續(xù)解凍。當(dāng)凍存管中只剩一點小冰粒時，酒精棉擦拭凍存管外表面，移入生物安全柜/超凈工作臺。
(2)從-80℃或液氮中取出凍存的細(xì)胞，迅速酒精擦拭凍存管外表面，移入生物安全柜/ 超凈工作臺，向凍存管內(nèi)加入適量預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，并輕輕吹打以促使細(xì)胞融化。這個做法適合凍存管中有足夠空間以容納新加入的新鮮培養(yǎng)基。自己可以嘗試一下，哪種方法細(xì)胞融化速度快就用哪種方法。個人認(rèn)為第 2 種快。
3、 接種細(xì)胞：
此時做法有 3 種選擇：
(1)如果是對凍存液成分耐受的細(xì)胞，可將凍存管中的細(xì)胞直接吸入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶/皿， 輕輕十字搖晃混勻細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。
(2)如果是對凍存液成分不耐受的細(xì)胞，將凍存管中的細(xì)胞吸入準(zhǔn)備好的 15ml 離心管中，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶/皿。
(3)如果是對凍存液成分不耐受的細(xì)胞，用解凍細(xì)胞第 2 種方法的，可以直接用凍存管離心，500g ×3min 離心，去除上清，1ml-2ml 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶/皿。
4、 第二天光鏡下觀察細(xì)胞。如果是帶著凍存液一起接種的細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行換液。
細(xì)胞換液
細(xì)胞換液是指去除舊的培養(yǎng)基，換成新的完全培養(yǎng)基以繼續(xù)提供細(xì)胞充足的營養(yǎng)支持。當(dāng)舊培養(yǎng)基 ph 值改變（含酚紅的培養(yǎng)基通常是變酸發(fā)黃）時，需要及時進(jìn)行換液。
步驟：
1、 準(zhǔn)備工作：
預(yù)熱完全培養(yǎng)基，酒精棉擦拭培養(yǎng)基瓶外表面后移入生物安全柜/超凈工作臺。
細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出的細(xì)胞，酒精棉擦拭培養(yǎng)瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超凈工作臺。可以稍等待，待生物安全柜中的循環(huán)風(fēng)將試劑瓶和培養(yǎng)瓶的外表面吹拂幾分鐘后，擰開培養(yǎng)基瓶蓋虛掩，擰開培養(yǎng)瓶瓶蓋虛掩，培養(yǎng)皿蓋不用擰。
2、 換液：
如果是貼壁細(xì)胞，可以用全量換液法，直接吸去全部舊培養(yǎng)基，補充足量新鮮完全培養(yǎng)基。
如果是懸浮細(xì)胞，可以用半量換液法，即吸去一半舊培養(yǎng)基，補充新鮮完全培養(yǎng)基。（會損失一半細(xì)胞）。懸浮細(xì)胞如果不想損失細(xì)胞，那就需要將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管中，離心去除舊培養(yǎng)基，再用新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
不光細(xì)胞維持培養(yǎng)時需要進(jìn)行細(xì)胞換液，一些實驗操作也需要進(jìn)行細(xì)胞換液。當(dāng)換液操作是實驗需要時，可能在添加新的培養(yǎng)基前需要 PBS 清洗細(xì)胞以去除舊培養(yǎng)基的影響， 新添加的培養(yǎng)基也可根據(jù)實驗需求進(jìn)行特殊配制，不一定是完全培養(yǎng)基。
細(xì)胞傳代
細(xì)胞傳代是指將細(xì)胞培養(yǎng)物分出來，重新接種到新的培養(yǎng)瓶/皿內(nèi)，使細(xì)胞重新獲得足夠的生長空間的過程。
對單層生長的貼壁細(xì)胞而言，當(dāng)細(xì)胞匯合度為 80%左右時，細(xì)胞狀態(tài)是最好的，此時適合進(jìn)行傳代。
1、 準(zhǔn)備工作：
預(yù)熱完全培養(yǎng)基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細(xì)胞的試劑，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超凈工作臺。
細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出的細(xì)胞，酒精棉擦拭培養(yǎng)瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超凈工作臺?？梢陨缘却?，待生物安全柜中的循環(huán)風(fēng)將試劑瓶和培養(yǎng)瓶的外表面吹拂幾分鐘后，擰開試劑瓶蓋虛掩，擰開培養(yǎng)瓶瓶蓋虛掩，培養(yǎng)皿蓋不用擰。
2、 細(xì)胞消化：
吸去舊的培養(yǎng)基，DPBS 洗細(xì)胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或無動物成分來源的 TryplLE），輕輕晃動培養(yǎng)瓶/皿，使消化液能均勻布滿所有細(xì)胞。
一些強貼壁的細(xì)胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗細(xì)胞，并在 37℃進(jìn)行消化（加上消化液后放進(jìn) 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱）。
用含EDTA 的胰蛋白酶來消化細(xì)胞的話，消化速度會更快。
強貼壁細(xì)胞或用特殊的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞使用 TrypLE 消化。
細(xì)胞消化的同時可以準(zhǔn)備新的培養(yǎng)瓶/皿，往培養(yǎng)瓶/皿中添加適量新鮮培養(yǎng)基。
3、 終止消化：
當(dāng)鏡下觀察貼壁細(xì)胞直接的連接松散，細(xì)胞有所變形，但還沒有出現(xiàn)大片脫落時，吸去消化液，稍待一兩分鐘，讓殘留在細(xì)胞表面但是肉眼看不見的消化液進(jìn)一步消化。
加入適量完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞（用一層層“掃描”方式來吹打），不要忘了沿邊“清掃”。胰蛋白酶可以被完全培養(yǎng)基中含的血清終止。
EDTA 無法被終止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的細(xì)胞，可以在加完全培養(yǎng)基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。
TrypLE 無需終止，DPBS 稀釋即可，因此也可以在加完全培養(yǎng)基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。
最好控制不要消化過度，細(xì)胞成片脫落。當(dāng)細(xì)胞消化過度時，只能通過離心去除消化液了。
吹打細(xì)胞時注意輕柔，控制泡沫，以免對細(xì)胞造成太多的細(xì)胞損傷。吸不凈，吹不凈， 槍尖始終保持在液體中可以有效控制泡沫產(chǎn)生。
4、 接種細(xì)胞：
在加入新培養(yǎng)基吹打細(xì)胞時即可規(guī)劃好，打算一盤細(xì)胞分成 N 盤，那就用 0.5N/1N ml 培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞吹打。
將細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液后即可每個新瓶/皿接種 0.5 或 1ml，十字混勻后，送入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
通常細(xì)胞可以 1:2、1:3、1:4 傳。有些細(xì)胞不能傳太稀，容易狀態(tài)不好生長緩慢。
對懸浮細(xì)胞而言，因為不需要消化，傳代過程比較簡單，直接吸取一定量舊培養(yǎng)物接種到新培養(yǎng)瓶/皿即可。
細(xì)胞凍存
細(xì)胞凍存主要為了細(xì)胞保種，是指將細(xì)胞置于保護(hù)性液體中于低溫中長期儲存的技術(shù)。
對單層生長的貼壁細(xì)胞而言，當(dāng)細(xì)胞匯合度為 80%左右時，細(xì)胞狀態(tài)是最好的，此時適合進(jìn)行凍存。
步驟：
1、 準(zhǔn)備工作：
預(yù)熱完全培養(yǎng)基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解離細(xì)胞的試劑、DMSO 或無血清細(xì)胞凍存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超凈工作臺。
細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出的細(xì)胞，酒精棉擦拭培養(yǎng)瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超凈工作臺。準(zhǔn)備無菌細(xì)胞凍存管和 15ml 離心管，移入生物安全柜/超凈工作臺。
準(zhǔn)備程序凍存盒（恢復(fù)至室溫）。如果使用添加異丙醇的程序凍存盒，注意異丙醇的量， 如不足，需添加，并且應(yīng)該根據(jù)程序凍存盒說明書定期更換異丙醇。
2、 細(xì)胞消化和終止：
按細(xì)胞傳代的做法進(jìn)行細(xì)胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液。對懸浮細(xì)胞而言，無需消化，直接進(jìn)入下一步離心收集細(xì)胞。
3、 離心收集細(xì)胞：
將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管，500g×3min 離心，去除上清。
4、 凍存液重懸細(xì)胞：
如使用無血清細(xì)胞凍存液，直接吸取無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到凍存管中擰緊蓋子。
如使用自制的細(xì)胞凍存液，需要先配制好細(xì)胞凍存液，方法如下：
優(yōu)先使用培養(yǎng)該細(xì)胞的新鮮完全培養(yǎng)基配制，900ul 完全培養(yǎng)基+100ul DMSO=1ml 細(xì)胞凍存液（DMSO 含量 10%）。
DMSO 在加入培養(yǎng)基時會發(fā)熱，務(wù)必提前配制好凍存液，以免過熱損傷細(xì)胞。
對于嬌弱的細(xì)胞，可配成 2×細(xì)胞凍存液，先使用一定體積新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再逐滴滴加等體積 2×細(xì)胞凍存液（DMSO 終濃度還是 10%），吹打混勻，轉(zhuǎn)移到凍存管中。
自制細(xì)胞凍存液中的 DMSO 可適當(dāng)降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。
在凍存一些比較嬌弱的原代細(xì)胞時，凍存液中的完全培養(yǎng)基可以用胎牛血清替代，即凍存液中只含胎牛血清和DMSO。
凍存細(xì)胞的量可以參考傳代時的比例，原則是讓復(fù)蘇的細(xì)胞有充足的生長空間。推薦使用內(nèi)旋式細(xì)胞凍存管，比較安全。
有些細(xì)胞凍存管的管蓋設(shè)計是特殊的，當(dāng)?shù)谝淮胃杏X擰緊時，此時并沒有真正擰緊，可以進(jìn)一步擰，直到第二次感覺到擰緊。推薦使用這樣的凍存管，在溫度變化發(fā)生熱脹冷縮時不容易發(fā)生液體泄漏，減少污染的可能性。
5、 細(xì)胞程序凍存：
使用無血清凍存液重懸的細(xì)胞，無需程序降溫，直接塞-80℃冰箱降溫，第二天轉(zhuǎn)移到液氮中。
使用自配細(xì)胞凍存液的細(xì)胞，需放進(jìn)程序凍存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天轉(zhuǎn)移到液氮中。
-80℃不適合長期保存凍存細(xì)胞（大概 1-2 年吧）。液氮中凍存的細(xì)胞十年之久都可以復(fù)蘇成功。如需要更長期地保存細(xì)胞，應(yīng)該定期復(fù)蘇細(xì)胞后再次凍存。
程序凍存盒也可以自制，即使用大量脫脂棉花包裹凍存的細(xì)胞，或使用海綿包裹細(xì)胞。
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