今天學(xué)習(xí)測序相關(guān)知識

學(xué)習(xí)內(nèi)容

1. 怎么區(qū)分一二三代測序

2. 二代測序大體流程

3. NGS組學(xué)都包括哪些分類（粗略）

測序原理和過程

原理介紹視頻：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密碼： 密碼：bxsry4
文章《測序的世界》：http://m.itdecent.cn/p/101c14c3a1d2

• 一代測序-Sanger法測序（準(zhǔn)確，慢，成本高,至今仍是測序行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn)。）

Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列

• 二代測序-大規(guī)模平行測序（不準(zhǔn)確，快，成本降低）

illumina公司最優(yōu)，原理

1. DNA待測文庫構(gòu)建
2. 簇的創(chuàng)建
3. 橋式PCR擴增及變性
4. 測序

測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例，30x測序深度大約為1周。

• 三代測序-單分子測序技術(shù)（SMRT不準(zhǔn)確，納米技術(shù)準(zhǔn)確，成本低，快）

與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。 DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。

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組學(xué)分類

• 基因組學(xué)（核酸序列分析）

（1）全基因組測序（WGS）
（2）全外顯子組測序（WES）
（3）簡化基因組測序（RRGS）
①RAD-Seq基因組作圖（遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜）
②GBS核苷酸序列分析
③2bRAD基因定位
④ddGBS（也就是ddRAD）基因功能分析
（4）以全基因組測序為目標(biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)
（5）以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)

• 轉(zhuǎn)錄組學(xué)（基因表達分析）

（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（長鏈非編碼RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

作用：
（1）獲得物種或者組織的轉(zhuǎn)錄本信息
（2）得到轉(zhuǎn)錄本上基因的相關(guān)信息，如基因結(jié)構(gòu)功能等
（3）發(fā)現(xiàn)新的基因
（4）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化
（5）發(fā)現(xiàn)可變剪切
（6）發(fā)現(xiàn)基因融合
（7）基因表達差異分析

• 蛋白組學(xué)

作用：
（1）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)處理、蛋白及其修飾鑒定
（2）構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、相關(guān)軟件的開發(fā)和應(yīng)用
（3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測
（4）蛋白質(zhì)連鎖圖

• 代謝組學(xué)

（1）代謝物指紋分析
（2）代謝輪廓分析

測序發(fā)展史：150年的風(fēng)雨歷程

【陳巍學(xué)基因】Illumina測序化學(xué)原理（講的很好，小白能聽懂）

視頻概要：
芯片表面有8個通道，上面都做了化學(xué)修飾，兩種DNA引物通過共價鍵種在玻璃表面（不會被沖掉flowcel）。
DNA文庫：加了接頭的DNA（打斷，加A，加接頭）。
橋式PCR：將加了DNA文庫結(jié)合在芯片上擴增（接頭盒玻璃表面引物互補），然后NaOH解鏈，然后再結(jié)合接頭擴增，解鏈，擴增。。。
測序：帶熒光的dNTP確定堿基
Index：文庫中加了特定的序列，每個樣本加一個。標(biāo)記樣本來源。
雙端測序：正負(fù)向各測一遍

思維導(dǎo)圖

測序入門知識.png