本文主要是解決sgRNA體外切割活性效率的評估及圖形化展示。
軟件：
- Gel-Pro Analyzer
- ImageJ
一、Gel-Pro Analyzer分析
啟動Gel-Pro Analyzer，依次選擇："文件" > "打開" > "目標文件"
工具欄選擇 "1D-凝膠分析" > "顯示凝膠分析工具"
1.1. 在彈出的工具欄中，"選擇" >"泳道識別" > "添加泳道"
如果泳道寬度不能很好匹配條帶的寬，可以手動設置條帶的寬度（嘗試幾次）。
泳道選擇后如下：
此時匹配的泳道過長，需手動調整到合適的范圍；
1.2. 帶識別
添加泳道的同時，軟件會自動識別條帶，而識別往往并不精確，需要手動設置，。
選擇 "帶識別" > "刪除帶"
單擊泳道將識別帶一一刪除（紅色短線表示主帶的位置）；
然后，選擇 "增加帶"，依次在目的條帶位置單擊；結果如下：
圖中的藍色框指代的是主條帶的范圍，有時候不同藍框之間重疊，可以點擊圖片方框進行范圍調整。但是如果重疊嚴重則手動調整十分不方便，解決辦法：
當單擊增加帶后會出現曲線圖，或者單擊 "1D-凝膠分析" > "顯示曲線"，彈出曲線圖，然后在曲線上面單擊鼠標選擇范圍，更為便捷。
圖中的1就是增加帶的主帶位置，2/3分別是藍框的左右邊界線。
調整后的圖形，藍色線框應該互補重疊，互不干擾。
1.3. 數據導出：
"泳道曲線" > "文件" > "圖形拷貝到剪切板"（導出灰度圖片）
"文件" > "打印圖形" ， 以PDF文件存儲（注意調整圖片的方向和長寬比例）
點擊 "結果"，將給出灰度的結果
可以選擇 "文件" > “”數據拷貝到EXCEL " 保存。膠圖可以通過截屏截取，最終呈現的效果如下：
二、切割效率計算
如果按照上面給出的數據，顯然計算起來不是很準確。這時候需要用到ImageJ
2.1. "file" > "Open" > picture
選擇"矩形選框"
2.2. 框選圖中條帶，"Analyze" > "Gels" > "Set the First Lane"(快捷鍵Ctrl + 1)
移動選框至第二個區(qū)域(小手指是更改選框大小，箭頭是移動選框)
"Analyze" > "Gels" > "Set the Second Lane" (快捷鍵Ctrl + 2)
如果是最后一個，則選擇"Ctrl + 3"，會自動彈出所選區(qū)域圖形的峰圖
2.3 然后放大圖形會看到局部并不是閉合狀態(tài)的，所以需要用直線工具添加直線，使其閉合。然后直線工具，以一端為頂點做直線封閉峰圖。
2.4. 選擇魔術棒工具，點擊封閉的區(qū)域，直接彈出對應的值，據此可以計算相對含量的多少。
TIP：一定要在選擇一個空白的區(qū)域做背景校正！
2.5. 計算公式：
為什么是這個公式，仔細思考？不明白可以私信我釋疑。
延伸：
- ImageJ條帶分析中圖形的含義：
A: 方框選擇在條帶的中間區(qū)域：
圖片.png
B: 方框選擇在條帶的上方區(qū)域：
圖片.png
可以看出來，圖形曲線的規(guī)則是，在選定的方框區(qū)域，從上方到下方的條帶灰度曲線。
注：關于詳細的曲線理解，詳見文章理解ImageJ灰度分析圖
ImageJ泳道分析Bug破解
設置好第一條泳道后，移動選取至第二個條帶位置，無論如何設置（Set +2），總是莫名其妙的移動位置，如下圖。一直不得解，后在丁香園看到網友的話，茅塞頓開。
切忌寬度是高度的兩倍
