單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組人工注釋?zhuān)╩anual annotation）是單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)分析中的關(guān)鍵步驟，旨在通過(guò)生物學(xué)知識(shí)對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行分類(lèi)和功能鑒定。后續(xù)的分析都是基于以上定義結(jié)果，因此這一步非常關(guān)鍵。單細(xì)胞注釋做的不好，對(duì)后面分析的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重要影響。

為什么需要人工注釋?zhuān)?/h1>

• 自動(dòng)注釋工具的局限性：
  盡管自動(dòng)化工具（如SingleR、CellAssign）可利用參考數(shù)據(jù)庫(kù)（如Human Cell Atlas）進(jìn)行預(yù)測(cè)，但其準(zhǔn)確性依賴(lài)參考數(shù)據(jù)的完整性，且難以識(shí)別新細(xì)胞類(lèi)型或過(guò)渡狀態(tài)。根據(jù)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，自動(dòng)化注釋準(zhǔn)確率大約在80%之間，一些特殊物種、組織或者質(zhì)量不是很好的數(shù)據(jù)使用自動(dòng)注釋準(zhǔn)確率會(huì)更低。因此，人工手動(dòng)注釋被認(rèn)為是細(xì)胞類(lèi)型注釋的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
• 生物學(xué)背景的重要性：
  人工注釋結(jié)合已知的標(biāo)記基因（marker genes）和背景知識(shí)（如免疫細(xì)胞的CD標(biāo)記、神經(jīng)細(xì)胞的特定轉(zhuǎn)錄因子），并結(jié)合具體疾病類(lèi)型來(lái)判斷細(xì)胞類(lèi)型或狀態(tài)，可更靈活地驗(yàn)證或修正聚類(lèi)結(jié)果，但是人工注釋可能耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，并且存在主觀性。

人工注釋的核心方法

基于先驗(yàn)知識(shí)，人工注釋前我們需要知道樣本中包含有哪些主要的細(xì)胞類(lèi)型，需要分出那些大類(lèi)，其中那些大類(lèi)需要進(jìn)行細(xì)分，需要分為多少亞型。比如：心臟組織應(yīng)該有心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，PBMC中有應(yīng)該有T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。根據(jù)不同的樣本組織，選擇合適的marker基因進(jìn)行判斷。

1、 標(biāo)記基因：

• 查閱文獻(xiàn)相關(guān)疾病組織中報(bào)道的關(guān)鍵標(biāo)記基因
• 對(duì)聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行差異分析（如FindAllMarkers in Seurat）篩選聚類(lèi)特異性基因，與已知細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因比對(duì)（如上皮細(xì)胞的 EPCAM、T細(xì)胞的 CD3D）。
• 數(shù)據(jù)庫(kù)查找（這里例舉2個(gè)比較常見(jiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)）
  CellMarker
  支持物種：人類(lèi)（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）。
  組織/器官：覆蓋158個(gè)人類(lèi)組織（如心臟、肺、肝臟）和81個(gè)小鼠組織。
  細(xì)胞類(lèi)型：包含數(shù)千種細(xì)胞類(lèi)型及亞型（如CD4+ T細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞）。
  標(biāo)記基因數(shù)量：截至最新版本（如CellMarker 2.0），包含約13,605個(gè)標(biāo)記基因（人類(lèi)）和9,476個(gè)（小鼠）。
  PanglaoDB
  支持物種：人類(lèi)（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）。
  單細(xì)胞數(shù)據(jù)集：整合了來(lái)自1,000+單細(xì)胞研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（如10x Genomics、Smart-seq2等平臺(tái)）。
  細(xì)胞類(lèi)型：涵蓋超過(guò)200種主要細(xì)胞類(lèi)型及亞型（如神經(jīng)元亞型、免疫細(xì)胞亞群）。
  標(biāo)記基因數(shù)量：包含約6,000個(gè)高置信度標(biāo)記基因（截至最新版本）。

注：參考基因組使用版本不同，基因名有很多別名，導(dǎo)致與數(shù)據(jù)不符合，可以使用GeneCards進(jìn)行查看。

2、多層級(jí)注釋策略：

粗注釋?zhuān)簠^(qū)分大類(lèi)（如免疫細(xì)胞 vs. 非免疫細(xì)胞）；
細(xì)注釋?zhuān)杭?xì)分亞群（如CD4+ T細(xì)胞 vs. CD8+ T細(xì)胞）；
驗(yàn)證：通過(guò)通路分析（如GO、KEGG）或?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證（如流式細(xì)胞術(shù)）。

實(shí)例

2021年6月17日，南方醫(yī)科大學(xué) Bin Yang 研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表文章"Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases",使用單細(xì)胞測(cè)序探究成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性和發(fā)病機(jī)制。

1、大類(lèi)定義

首先對(duì) 40655 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)偏聚類(lèi)，顯示 21 個(gè)細(xì)胞簇。將這21個(gè)cluster分為了大類(lèi)，分別為：內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、免疫細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和“未知”群。

大類(lèi)定義

marker基因熱圖

marker基因umap圖

2、細(xì)分亞群
因?yàn)槌衫w維細(xì)胞（fibroblasts ）是纖維發(fā)病機(jī)制中最重要的細(xì)胞類(lèi)群。文章對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的亞群分析。對(duì)分出的不同cluster的細(xì)胞占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，也進(jìn)行了富集分析，探究其細(xì)胞的特征。如有必要還可以取出其中一個(gè)群再次進(jìn)行細(xì)分。

成纖維細(xì)胞亞群分析

比如張澤民課題組在把T細(xì)胞分的更細(xì)致。首先就是使用流式篩選針對(duì)CD4或者CD8的T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序再進(jìn)行后續(xù)分析。

實(shí)驗(yàn)方案

所有細(xì)胞分出了CD4與CD8兩大類(lèi)T細(xì)胞

T細(xì)胞定義

分別對(duì)CD8 T cells和CD4 T cells進(jìn)行細(xì)分， 其中，CD8 T cell分出8個(gè)亞群， CD4 T cells分出了12個(gè)亞群。文章給出了各自的高表達(dá)量基因的熱圖、tSNE圖和小提琴圖。當(dāng)然除此之外，我們還可以采取氣泡圖等其他形式進(jìn)行展示。

熱圖

tSNE

violin

氣泡圖示例，非此文章中的圖

文章也提供細(xì)胞亞群的生物學(xué)功能命名，以及各自的高表達(dá)量基因表格，后續(xù)相關(guān)的T細(xì)胞亞型定義可以參考這些marker基因。

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參考文獻(xiàn)

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