在準備NGS文庫的時候，會有用到轉(zhuǎn)座酶Tn5，Nextera DNA Library Preparation Kit ，比如ATAC-seq就有用到這個Tn5。轉(zhuǎn)座酶攜帶有特定的序列稱為轉(zhuǎn)座子Transposon。
下面是ATAC-seq的工作原理，想必聽說過ATAC-seq的，對這個圖都會再熟悉不過了。
Tn5是kit里面帶有的，沒什么大不同。ATAC-seq 的barcoded primers （adaptors）會有一些不同，接下來，看下圖中的每段序列對應的sequnce都是什么。
下面圖例，Nextera tn5用來給基因組DNA加adaptors。
在tn5二聚體里面的雙鏈的Oligo是Nextera Tn5 binding site，19個堿基，全部都是一樣的。伸出來的部分是單鏈的序列，藍色：Nextera tn5 read1 (5'-TCGTCGGCAGCGTC-3')；紅色：Nextera tn5 read2(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3')
Nextera Tn5 binding site (19-bp Mosaic End (ME)): 5'- AGATGTGTATAAGAGACAG -3’
Nextera N/S5xx primer entry point (s5)／Tn5 Read 1: 5'- TCGTCGGCAGCGTC -3'
Nextera N7xx primer entry point (s7)／ Tn5 Read 2: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG -3'
Illumina P5 primer 1: 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'
Illumina P7 primer 2: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3’
Tn5 Read 1 （包括ME）sequence: 5'- TCGTCGGCAGCGTC（AGATGTG，TATAAGAGACAG） -3’ （33bp）
Tn5 Read 2 （包括ME）sequence: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG（AGATGT，GTATAAGAGACAG ）-3’ （34bp）
下面的圖片就是準備ATAC-seq時候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一點類似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，沒有index （barcode），所以只有一個。Reversed引物有24個Ad2.（1-24），所以有24組不同的index （barcode）序列。這個index序列是和Nextera一樣的。我涂紅色部分就是index序列的反向反義序列，每個index序列是不同的8個堿基，這個和Nextera的i7（部分一樣，請自己對照）是一樣的。
i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里沒有barcode
N/S502 : CTCTCTAT
N/S503 : TATCCTCT
N/S505 : GTAAGGAG
N/S506 : ACTGCATA
N/S507 : AAGGAGTA
N/S508 : CTAAGCCT
N/S510 : CGTCTAAT
N/S511 : TCTCTCCG
N/S513 : TCGACTAG
N/S515 : TTCTAGCT
N/S516 : CCTAGAGT
N/S517 : GCGTAAGA
N/S518 : CTATTAAG
N/S520 : AAGGCTAT
N/S521 : GAGCCTTA
N/S522 : TTATGCGA
i7 sequence:
N701 : TCGCCTTA
N702 : CTAGTACG
N703 : TTCTGCCT
N704 : GCTCAGGA
N705 : AGGAGTCC
N706 : CATGCCTA
N707 : GTAGAGAG
N710 : CAGCCTCG
N711 : TGCCTCTT
N712 : TCCTCTAC
N714 : TCATGAGC
N715 : CCTGAGAT
N716 : TAGCGAGT
N718 : GTAGCTCC
N719 : TACTACGC
N720 : AGGCTCCG
N721 : GCAGCGTA
N722 : CTGCGCAT
N723 : GAGCGCTA
N724 : CGCTCAGT
N726 : GTCTTAGG
N727 : ACTGATCG
N728 : TAGCTGCA
N729 : GACGTCGA
1. 所以，ATAC-seq的這個Oligo designs （Adaptors）可以大概總結(jié)：
有兩種Adaptors，分別為Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。
其中Adaptor1（5’ illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3’），Adaptor2（5’ illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3’）
這樣算來，ATAC-seq library的長度=左面（Adaptor1 長度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA長度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 長度）=open chromatin 的DNA長度 + 128bp。
所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library長度大概是(單核小體146bp+核小體free region)+兩端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列長度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二個peak。圖中顯示大概是340bp左右。所以free region應該是330bp-274bp=56bp 。
那么會問，對不對呢？看下bioanalyzer的第一個peak，顯示是182bp，這個peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列長度 + 兩端的adaptor及Tn5部分ME序列長度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不難得出同樣的結(jié)果，nucleosome free region序列長度是54bp。差不多哦
以此類推，第三個peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之間，是不是等于兩個核小體長度加上核小體空隙序列再加上兩個adaptor， 2146bp + 255bp + 128bp= 530bp （為什么55bp也要乘2？答：多出來一個核小體當然就多出來一份核小體空隙）
綜上所述，ATAC-seq library長度比genome DNA實際長度一定多出128bp。
nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome
2. 下面一個問題，tagmentation時候，會出現(xiàn)gap？Nextera tagmentation on amplified cDNA (will create 9-bp gap）？
“GAP不是服裝品牌，而是個坑”。
所以需要在PCR第一步，需要5min的72攝氏度來填坑。
還要注意，就是在tagmentation的時候會出現(xiàn)三種產(chǎn)物，上面的圖只是其中一種。
哪里說的不對歡迎糾正，請留言。
參考：
http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Transposon_Tn5
http://nextgen.mgh.harvard.edu/attachments/Nextera%20Protocol.pdf
https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/SMART-seq_family.html
http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/ez-tn5-transposase.pdf?sfvrsn=4
