title: NormqPCR筆記對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)之一
date: 2019-10-01 12:00:00
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- miRNA
- qPCR
- 內(nèi)參
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前言
最近在處理qPCR數(shù)據(jù)過程中，設(shè)計(jì)的qPCR陣列中采用了多個(gè)內(nèi)參，我對(duì)于多內(nèi)參的處理不太理解。后來找到了一篇文獻(xiàn)，就是講qPCR中的多內(nèi)參問題的。文獻(xiàn)信息如下：
Vandesompele, J., et al. (2002). "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes." Genome Biology 3(7): research0034.0031.
此篇文獻(xiàn)引用量很高（到2019年10月為止，引用量約為16000），雖然文獻(xiàn)比較古老，但是了解一下文獻(xiàn)中的思想還是比較有用的，以下是文獻(xiàn)的閱讀筆記（基本上就是翻譯原文外加自己檢索）。
文獻(xiàn)中涉及一定的線性代數(shù)知識(shí)，我不太懂，只能先暫時(shí)先記錄下來，等看懂的時(shí)候再補(bǔ)充一篇筆記。
研究背景
? 在生物學(xué)研究中，基因表達(dá)的分析有著重要的作用。對(duì)于基因表達(dá)模式的理解可以為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供思路。最近開發(fā)的兩種檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本豐度的方法得到了非常廣泛的應(yīng)用（該文章是2002年寫的，這里的最近已經(jīng)是非常久遠(yuǎn)了）。微陣列的方法（微陣列其實(shí)就是芯片法）可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的基因表達(dá)情況，而RT-PCR的方法則是用于檢測(cè)許多不同的樣本中數(shù)量有限基因的表達(dá)情況（在細(xì)胞數(shù)量比較少的情況下用這種方法更好，說服力更強(qiáng)）。與傳統(tǒng)的方法例如northern-blot，核糖核酸酶保護(hù)，或者是競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR（competitive rt-PCR）相比，這兩種方法（微陣列與RT-qPCR）都有快速，高通量的優(yōu)點(diǎn)。但是這兩種方法都需要與傳統(tǒng)方法一樣，需要對(duì)目的mRNA進(jìn)行均一化（normalization）。
以下是補(bǔ)充一些與核酸保護(hù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)的背景知識(shí)。
核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)
? 糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（Ribonuclease protection assay，RPA）是一種mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。
? 對(duì)于32P標(biāo)記的探針，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào); 對(duì)于生物素標(biāo)記的探針，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，采用鏈霉親和素－辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)。
? 在利用RT-PCR對(duì)基因進(jìn)行定量時(shí)，為了縮小誤差，我們需要對(duì)一些因素進(jìn)行控制，例如原始樣品的數(shù)量（細(xì)胞或者是組織），酶的效率，組織或細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)差異等因素。在控制條件的理想情況下，提取的高質(zhì)量RNA的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的可重復(fù)結(jié)果與細(xì)胞數(shù)量是呈正比的，但是精確的細(xì)胞數(shù)目很難進(jìn)行定量（尤其是當(dāng)原始材料是組織時(shí)更是如此）。
? 另外一種常用的定量手段就是RNA的量（這里指的是數(shù)量，原文寫的是mass quantity），尤其是northern blot分析方法。但是這種方法也存在著一些爭(zhēng)議。因?yàn)檫@種方法沒有考慮到RNA的質(zhì)量（這里側(cè)重的是RNA的完整性，原文寫的是quality）與相關(guān)酶的反應(yīng)效率。此外，在某些情況下，這些因素也無法定量，例如從提取的微切割的組織（microdissected tissue）中得到的RNA數(shù)量極少，這個(gè)時(shí)候就無法對(duì)RNA進(jìn)行定量。
? 其中最大的爭(zhēng)議還在于，用于均一化時(shí)所考慮的總RNA量，因?yàn)榭偟腞NA主要是由rRNA組成的，它并不代表mRNA。這里大概介紹一下使用總RNA量來作為RNA質(zhì)控的方法。
? 當(dāng)我們提取了RNA后，在進(jìn)行質(zhì)控時(shí)，通常是使用1%的瓊脂糖凝膠電泳來跑200ng到400ng的總RNA，然后觀察RNA的條帶。良好的RNA（這里指的是動(dòng)物組織或細(xì)胞的樣本）中可以看到3個(gè)條帶，從上到下依次是28S、18S、5S（這是核糖體RNA的主要成分），其中28S條帶與18S條帶非常清楚，5S條件非常弱，28S和18S比值可以判斷RNA樣本的完整性，通常這個(gè)比值是1.5（肉眼不太好判斷，通常來說就是28S比18S亮就行了），如果這兩個(gè)條帶變?nèi)酰?S條件變亮，則說明RNA降解，如下所示：
? 不過電泳法是比較粗糙的方法，畢竟這篇文獻(xiàn)是2002年的，現(xiàn)在如果要進(jìn)行測(cè)序建庫，要求就比較高，會(huì)采用Qubit檢測(cè)RNA的濃度，用安捷倫2100來檢測(cè)RNA的完整性，具體的檢測(cè)指標(biāo)可以檢索相關(guān)資料。
但是在總的RNA中，mRNA的含量?jī)H占7.5%。此外，還有報(bào)告指出，rRNA的轉(zhuǎn)錄還受到生物因素與藥物的影響。利用18S或28S作為RNA定量的標(biāo)準(zhǔn)缺陷還在于，在純的mRNA分子中，并不含有18S或28S，與靶mRNA轉(zhuǎn)錄本相比，18S或28S的含量太高。在利用RT-PCR進(jìn)行分析時(shí)，很難排除基線(baseline)。
現(xiàn)在補(bǔ)充一些競(jìng)爭(zhēng)性PCR的背景知識(shí)。
競(jìng)爭(zhēng)性PCR
? 在競(jìng)爭(zhēng)性PCR中，逆轉(zhuǎn)錄之前加入一個(gè)外源的RNA轉(zhuǎn)錄本（內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)RNA）作為樣品間差異的對(duì)照。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)RNA被逆轉(zhuǎn)錄并同目的模板一起擴(kuò)增，作為cDNA轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增效率差異的對(duì)照。通過將特異性的目的序列同已知濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)RNA一起擴(kuò)增進(jìn)行定量。通過比較由內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)獲得的信號(hào)和目的模板所獲得的信號(hào)可以確定目的模板的豐度。
? 到目前為止（也是2018年為止），內(nèi)參基因是最常用的對(duì)mRNA進(jìn)行均一化的方法。內(nèi)參基因（internal control）通常指的是管家基因（housekeeping gene），這類基因并不會(huì)隨著組織或細(xì)胞的不同而變化， 或者是不會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)條件而變化。但是在許多的研究里，研究者使用的這些持續(xù)表達(dá)的內(nèi)參基因中，并沒有對(duì)這些基因的穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。文獻(xiàn)中使用的這些管家基因偶爾會(huì)出現(xiàn)變化極大的現(xiàn)象。隨著RT-PCR靈敏度，可靠性以及使用范圍的增加，對(duì)于合適內(nèi)參基因的需求也日益迫切。些外，通過利用利用公共微陣列數(shù)量，這種均一化因素（normalization factor）也在廣泛的應(yīng)用的微陣列定標(biāo)系數(shù)（scaling factor）中得到了驗(yàn)證。
需要了解的幾個(gè)公式
文獻(xiàn)末尾處提到了幾個(gè)公式，現(xiàn)在匯總?cè)缦滤荆?/p>
公式1:單一內(nèi)參均一化錯(cuò)誤值（Single control normalization error）
公式上面的英文注釋如下所示：
E值： 對(duì)于任何m個(gè)樣本，用real-time RT-PCR技術(shù)可以測(cè)量其n個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)水平，其表達(dá)水平為aij。對(duì)于每2個(gè)樣本（分別記為p和q）的組合來說，它們的兩個(gè)內(nèi)參基因j和k的每一種組合來說，可以計(jì)算出它們的單一內(nèi)參均一化錯(cuò)誤值E（single control normalization error，公式1）。
當(dāng)樣本p和q分別針對(duì)其內(nèi)參基因j或k進(jìn)行均一化的時(shí)候，其樣本p和樣本q的表達(dá)總倍數(shù)差異就是錯(cuò)誤值E。 n表示內(nèi)參的數(shù)目（注：既然是多內(nèi)參，這個(gè)n必然是大于等于2）。
aij表示的是內(nèi)參的表達(dá)水平（這是一組數(shù)據(jù)）。
j與k的范圍為1到n，p與q的值為1到m（都是閉區(qū)間），并且j不等于k，p不等于q。Rjkpq的倒數(shù)就是E值，公式1中，aqj是說在樣本q中，以內(nèi)參基因j為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化后的數(shù)據(jù)，aqk則是說，以內(nèi)參基因k為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化后的數(shù)據(jù)，aqj/aqk則是這二者之比，apk/apj為例，aqj/aqk與apk/apj的比值則是指p與q樣本中，a基因表達(dá)水平的誤差。
個(gè)人理解：這個(gè)E值其實(shí)就是每個(gè)樣本，每個(gè)內(nèi)參均一化后誤差的乘積。
公式2:內(nèi)參基因穩(wěn)定檢測(cè)值M
原文如下所示：
公式解釋：
M值：對(duì)于任意兩個(gè)內(nèi)參基因j與k，可以計(jì)算出由它們構(gòu)成的一個(gè)Ajk數(shù)列（array），這個(gè)數(shù)列包含一組經(jīng)log2轉(zhuǎn)化來的比值（aij/aik），如果是m個(gè)樣本，那么Ajk中一共是m個(gè)值（公式2）。作者定義Vjk是內(nèi)參基因j和k的成對(duì)變異（pairwise variation）它是Ajk的標(biāo)準(zhǔn)差（公式3）。其中內(nèi)參基因j的穩(wěn)定表達(dá)值Mj就是所有成對(duì)基因變異Vjk的算術(shù)平均數(shù)（公式4）。
畫個(gè)圖，如下所示：
以上計(jì)算的只是內(nèi)參基因j的穩(wěn)定值。
研究思路
提取了不同組織或細(xì)胞的RNA進(jìn)行檢測(cè)，然后檢測(cè)這些RNA中的幾個(gè)選定的內(nèi)參，再通過一定的算法進(jìn)行比較。
實(shí)驗(yàn)過程
（一）管家基因表達(dá)譜
? 本文研究了10個(gè)常用管家基因在人類13個(gè)不同組織中的表達(dá)，這10個(gè)管家基因如下所示：
管家基因列表。
注：選這個(gè)10個(gè)管家基因的思路是要盡量使這10個(gè)基因?qū)儆诓煌墓δ芊诸?，這樣就能極大地了降低它們之間存在的共調(diào)控現(xiàn)象。
作者檢測(cè)了80個(gè)組織中的這10個(gè)管家基因的表達(dá)情況，這80個(gè)組織分別為：在34個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤（來源不同的實(shí)驗(yàn)室以及不同的病人，NB1-34）；20個(gè)短期培養(yǎng)的常規(guī)成纖維細(xì)胞（FIB1-20）；13個(gè)常規(guī)的淋巴細(xì)胞樣本（LEU1-13）；9個(gè)骨髓樣本（BM1-9）；9個(gè)其他的人類正常組織（分別為heart，brain，fetal brain，lung，trachea，kidney，mammary gland，small intestine和uterus）。
（二）單一內(nèi)參均一化錯(cuò)誤值（Single control normalization error）
Figure 1 -對(duì)于兩個(gè)理想的內(nèi)參基因來說，E值等于1，這個(gè)很好理解，我們還看一下前面的E公式，如下所示：
也就是說，理想的兩個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)水平必然是相同的，因此E等于1。
事實(shí)上觀察到的E值通常大于1，這就構(gòu)成了兩個(gè)樣本之間的E倍差異，具體的差異值取決用于均一化的特定管家基因。對(duì)所有的10個(gè)內(nèi)參基因兩兩配對(duì)（一共45種組合），以及所有樣本的兩兩配對(duì)（一共是865個(gè)組合）繪制E值，如figure 1所示。此外，通過分析重復(fù)運(yùn)行的相同內(nèi)參基因繪制出了系統(tǒng)錯(cuò)誤的分位數(shù)。E值的75百分位數(shù)和90百分位分別是3.0（范圍是2.1-3.9）和6.4（范圍是3.0-10.9）。
注：所有樣本的兩兩配對(duì)是指，同一個(gè)組織內(nèi)的兩兩配對(duì)，因此根據(jù)前面的內(nèi)容：
34個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤（來源不同的實(shí)驗(yàn)室以及不同的病人，NB1-34）；20個(gè)短期培養(yǎng)的常規(guī)成纖維細(xì)胞（FIB1-20）；13個(gè)常規(guī)的淋巴細(xì)胞樣本（LEU1-13）；9個(gè)骨髓樣本（BM1-9）；9個(gè)其他的人類正常組織（分別為heart，brain，fetal brain，lung，trachea，kidney，mammary gland，small intestine和uterus）
排列組合數(shù)目就是865。
（三）基因表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)以及所選基因的秩
? 在研究中，通常會(huì)認(rèn)為基因的表達(dá)水平應(yīng)該精選一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的基因進(jìn)行均一化。但是為了驗(yàn)證選定的這個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)，我們需要一種可靠的檢測(cè)手段手段來確定這個(gè)內(nèi)參基因確實(shí)是穩(wěn)定表達(dá)的，從而剔除掉非特異性的變異。為了解決這個(gè)循環(huán)問題（circular problem），作者以非均一化表達(dá)水平為基礎(chǔ)，提出了一種基因穩(wěn)定性檢測(cè)算法。
? 這種算法的原理是，無論實(shí)驗(yàn)條件，無論細(xì)胞類型，兩種理想的內(nèi)參基因在所有樣本中的表達(dá)必然是相同的。而在實(shí)際條件下，兩種真實(shí)內(nèi)參基因的表達(dá)比值（ratio）的變異就會(huì)反映出一種（或者是兩種）內(nèi)參基因的表達(dá)并非是恒定不變的，這種比值的差異與基因表達(dá)的穩(wěn)定程度呈反比。對(duì)于每一個(gè)內(nèi)參基因來說，作者都研究了它與其他所有內(nèi)參基因兩兩的差異，這種差異用表達(dá)比值的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的標(biāo)準(zhǔn)差來表示，并且定義了一個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定檢測(cè)值M作為一個(gè)特定基因與其他所有內(nèi)參基因的平均兩兩變異。
? 其中，最小M值的基因是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。假如選定的這些內(nèi)參基因不存在共調(diào)控，那么分步排除掉的最高M(jìn)值的基因后，最終剩下的內(nèi)參基因就會(huì)產(chǎn)生一對(duì)組合，構(gòu)成這種組合的兩個(gè)基因是穩(wěn)定表達(dá)的管家基因，即它們是樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
? 為了計(jì)算最佳的內(nèi)參基因組合，作者利用VBA開發(fā)了一個(gè)Excel插件，命名為geNorm，它能自動(dòng)計(jì)算所有內(nèi)參基因的的M值（現(xiàn)在這個(gè)插件已經(jīng)整合到了qbase+中，網(wǎng)址為：https://www.qbaseplus.com/）。這個(gè)程序可以剔除那些不好的內(nèi)參基因（即最高M(jìn)值的基因），并且重新計(jì)算剩余內(nèi)參基因的M值。利用geNorm，作者計(jì)算了5類組織中的10個(gè)內(nèi)參基因的M值，并按從大到小的順序排列（參見figure2與table 3）。此外，作者還計(jì)算了系統(tǒng)變異，其方法對(duì)相同的基因進(jìn)行重復(fù)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，這種變異反映了儀器自身，加樣，酶的固有變異。
Figure 2 橫坐標(biāo)表示的是剩余的內(nèi)參數(shù)目。
注：qbase+這個(gè)軟件我并不熟悉，這是沒有重現(xiàn)數(shù)據(jù)的分析過程。但是在前一篇筆記中，我使用了NormqPCR這個(gè)R包來重現(xiàn)了數(shù)據(jù)分析過程。
（四）基于多內(nèi)參基因的幾何均數(shù)進(jìn)行均一化因子計(jì)算
? 為了精確地評(píng)估基因的表達(dá)水平，作者推薦使用多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行均一化。將多個(gè)內(nèi)參取幾何均數(shù)。至于使用的內(nèi)參基因數(shù)目，需要在實(shí)際情況與精確性方面進(jìn)行取舍。但是就實(shí)際情況來看，選擇太多的內(nèi)參基因浪費(fèi)（例如10個(gè)太浪費(fèi)了），如果太少，不為精確，作者推薦最少使用3個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為均一化因子（normalizaiton factor, NFn, n=3）。
? 作者還研究了一些情況，即那些利用了超過3種內(nèi)參基因用于均一化的情況，作者計(jì)算了相同組織類型內(nèi)的所有樣本，按照兩次均一化因子（NFn和NFn+1）的兩兩變異Vn/n+1（即aij=NFn,i和aik=NFn+1,n代表用于均一化的基因數(shù)目，范圍是3到9，i表示樣本，具體參照公式2和3）。我的理解是，在選定了幾個(gè)內(nèi)參，例如5個(gè)，對(duì)所有的樣本進(jìn)行均一化，計(jì)算其變異，即V5，然后再排除一個(gè)內(nèi)參，剩了4個(gè)內(nèi)參，再對(duì)所有的樣本均一化，計(jì)算其變異，即V4，最后計(jì)算V4/V5）。這種算法研究的是，如果存在著一個(gè)很大的變異，就意味著，這個(gè)加入的內(nèi)參基因（我的理解是，排除的那個(gè)內(nèi)參）有著很強(qiáng)的效應(yīng)，它應(yīng)該優(yōu)先選擇用于均一化因子的計(jì)算（不太理解這種算法）。
? 對(duì)于所有的組織類型，用于計(jì)算的均一化因子是3個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，通過逐步添加剩余的7個(gè)內(nèi)參基因。逐步計(jì)算兩兩配對(duì)變異，對(duì)于連續(xù)的NFn和NFn+1均一化因子，這就反應(yīng)了加入的第n+1基因的效應(yīng)。
（如figure 3a所示）。從圖中可以明顯看出來，對(duì)于leukicytes, fibroblast和bone marrow來說，添加的第4個(gè)基因沒有特別明顯的影響（就是說低V3/4值），這也說明，在NF3和NF4值之間存在著很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，如figure 3b所示。以這些數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，作者采用了0.15作為閾值，低于0.15的內(nèi)參基因不需要添加進(jìn)來。對(duì)于neuroblastoma和正常組織來說，分別需要加入1個(gè)和2個(gè)內(nèi)參基因（參見figure 3b）。最高的V8/9和V9/10值對(duì)于normal pool，neuroblastoma和leukocyte來說就確認(rèn)了figure 2中逐步排除的最差內(nèi)參基因。這種分析表明了平均M值的在開始時(shí)的強(qiáng)烈下降，這就指出了，leukocyte的兩個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)異常，neuroblastoma和normal tissues一個(gè)內(nèi)參基因的不穩(wěn)定。此外，對(duì)于后兩種組織來說，需要包含另外的內(nèi)參基因，從而與內(nèi)參基因的高度變異保持一致。
驗(yàn)證可能的RT-PCR均一化因子
? 為了驗(yàn)證這種基因檢測(cè)算法的可靠性，即最低M值是最穩(wěn)定的表達(dá)的內(nèi)參基因，作者檢測(cè)了每個(gè)內(nèi)參基因的特異性變化，作為均一化之后表達(dá)的變異系數(shù)（variation coefficient）。對(duì)于合適的內(nèi)參基因來說，這個(gè)系數(shù)應(yīng)該是最小的。作者以三個(gè)基因的幾何平均數(shù)為基礎(chǔ)，分別計(jì)算了三個(gè)不同的均一化因子，最低的M值（NF3（1-3）），最高的M值（NF3（8-10）和中等的M值（NF3（6-8））。接著，作者計(jì)算用最低變異系數(shù)，在每種組織類型內(nèi)，計(jì)算了這三個(gè)基因的平均基因特異性變異（figure 4a）。從計(jì)算結(jié)果可以看出，當(dāng)數(shù)據(jù)用NF3（1-3）進(jìn)行均一化時(shí)，這些基因特異性變異最小。
? 這就表明，基因穩(wěn)定性檢測(cè)能夠確定地確定表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。為了確認(rèn)高M(jìn)值是一類表達(dá)不穩(wěn)定，或者是表達(dá)有差異的基因，作者分析了MYCN的表達(dá)水平，MYCN這個(gè)基因是一種在neuroblastoma中表達(dá)有差異的基因。在neuroblastoma中，MYN的M值是6.02，而B2M（表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因）的M值是2.17。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，用單一的內(nèi)參基因進(jìn)行均一化會(huì)導(dǎo)致其它內(nèi)參基因更高的的基因特異性變異，這就進(jìn)一步說明了利用多個(gè)管家基因進(jìn)行均一化的優(yōu)勢(shì)。
? 為了說明最佳的個(gè)內(nèi)參基因不受細(xì)胞增殖的影響，作者分析了PCNA的表達(dá)水平（PCNA是增殖的標(biāo)志），研究了四個(gè)最佳管家基因和標(biāo)志基因PCNA之間的Spearman秩相關(guān)系數(shù)。從分析結(jié)果來看，管家基因之間存在著關(guān)聯(lián)（p值小于0.001，相關(guān)系數(shù)在0.6到0.76之間）。相比之下，PCNA和三個(gè)管家基因之間不存在聯(lián)系，而與HPRT1則存在著弱相關(guān)（p值為0.024，相關(guān)系數(shù)為0.43）。這些數(shù)據(jù)清楚地說明了，最穩(wěn)定的管家基因與細(xì)胞的增殖狀態(tài)無關(guān)。
? 為了進(jìn)一步研究選定的內(nèi)參基因幾何均數(shù)的精確性，作者研究了公共數(shù)據(jù)庫中的微陣列數(shù)據(jù)，利用這些數(shù)據(jù)中的內(nèi)參基因的幾何均數(shù)進(jìn)行了均一化，具體的選擇過程參見文獻(xiàn)，作者選定了5個(gè)內(nèi)參基因，其標(biāo)準(zhǔn)是M值小于0.7，其計(jì)算結(jié)果與微陣列的計(jì)算結(jié)果類似。
組織特異性管家基因的表達(dá)
? 為了比較13所測(cè)組織中的管家基因表達(dá)水平的異質(zhì)性。作者剔除了差異最大的4個(gè)管家基因（這4個(gè)管家基因分別為B2M，RPL13A，ACTB與HMBS，參見Table 2）后，計(jì)算了6個(gè)內(nèi)參基因的幾何均數(shù)作為“偽內(nèi)參”，然后將這10個(gè)內(nèi)參基因再根據(jù)這個(gè)“偽內(nèi)參”進(jìn)行均一化。Figure 5顯示了所有的10個(gè)基因的不同豐度類型，表達(dá)最高的ACTB基因是最低的HMBS的400倍。雖然內(nèi)參基因的豐度在不同的組織中類似，但還是觀察到了組織特異性表達(dá)的差異，例如，B2M的表達(dá)水平在leukocytes中比Fetal Brain中高出112倍，而Fibroiblast和Heart tisssue中，ACTB的差異有22倍。與這兩個(gè)基因相比，有2個(gè)基因的表達(dá)比較穩(wěn)定，例如UBC和HPRT1。
討論部分略。
參考資料：
