本文發(fā)表在MOLECULAR CANCER,https://doi.org/10.1186/s12943-020-01178-6,喜歡的小伙伴可以去下載。
腫瘤再生長是放射治療失敗的主要原因。以往的研究表明，死亡的腫瘤細(xì)胞通過促進(jìn)殘留的腫瘤再生細(xì)胞(TRCs)的增殖，在腫瘤再增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。然而，TRCs在放療后也會(huì)遭受DNA損傷，并可能在瀕死細(xì)胞釋放的增殖因子的刺激下發(fā)生有絲分裂災(zāi)難。因此，我們打算找出這些自相矛盾的生物學(xué)過程是如何協(xié)調(diào)起來的，以增強(qiáng)放療后腫瘤的再增殖。垂死的腫瘤細(xì)胞來源的外體誘導(dǎo)G1/S阻滯，促進(jìn)DNA損傷反應(yīng)，通過傳遞miR-194-5p進(jìn)一步調(diào)節(jié)E2F3的表達(dá)，從而增強(qiáng)TRCs的存活。此外，外體miR-194-5P可減輕放療時(shí)致癌HMGA2的毒副作用。在潛伏一段時(shí)間后，垂死的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步釋放大量的PGE2來促進(jìn)恢復(fù)的TRCs的增殖，并協(xié)調(diào)了再繁殖級(jí)聯(lián)反應(yīng)。值得注意的是，小劑量阿司匹林被發(fā)現(xiàn)通過抑制外切體和前列腺素E2的分泌來抑制胰腺癌放療后的再生長，直接上圖吧，說的太多了，聽不明白。
本文從臨床表現(xiàn)———胰腺癌放療后增殖加速——出發(fā)，從而開展臨床研究。放療過程中的DNA損傷如果不被修復(fù)的話，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死亡，所以必定會(huì)存在腫瘤細(xì)胞在放療后周期進(jìn)程阻滯而且伴隨DNA修復(fù)，而且，在這個(gè)過程后，腫瘤增殖增速？？？？厲害了，這聽著像不像腫瘤干細(xì)胞特性。安利一個(gè)胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記（c-met、CD44、CD133、LGR5、ALDH1），這個(gè)TRCs是不是也是這樣呢，這種DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞死亡而且又有快速增殖過程，是不是矛盾？看作者作何解釋
作者先用10y輻照后的細(xì)胞（feeder）與報(bào)告細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)內(nèi)腫瘤增殖受到抑制，阻滯在G0-G1期，但是36小時(shí)后被逆轉(zhuǎn)。和輻照后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清培養(yǎng)時(shí)也有類似表現(xiàn)。
作者把輻射后的細(xì)胞與未輻射的細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，GO分析表明在細(xì)胞外囊泡生成功能上富集。
那問題來了，是不是輻射后的外泌體分泌增多了呢？作者又是一頓驗(yàn)證。果不其然，確實(shí)如此。具體方法就是收集外泌體后進(jìn)行NTA計(jì)數(shù)。
在患者腫瘤裸鼠移植物模型（PDX）也發(fā)現(xiàn)照射后外泌體指標(biāo)（CD63，CD81，TSG101）表達(dá)升高，將受輻照的細(xì)胞外泌體與腫瘤培養(yǎng)提，EDU實(shí)驗(yàn)表明腫瘤生長受到抑制。
輻照細(xì)胞的外切體耗盡的CM失去了抑制作用。BrdU摻入試驗(yàn)表明，體內(nèi)給藥照射的垂死腫瘤細(xì)胞來源的外泌體也抑制了皮下腫瘤的增殖。這些數(shù)據(jù)表明，增殖抑制作用在很大程度上是由于死亡的細(xì)胞來源的外切體所致。
作者也真是受累，到現(xiàn)在只驗(yàn)證了外泌體在這個(gè)過程的作用，接著作者又作了克隆形成實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證外泌體處理后的腫瘤細(xì)胞增殖能力的，這不應(yīng)該是受到輻射的腫瘤外泌體抑制腫瘤增殖嗎？可是結(jié)果卻是這個(gè)，這個(gè)表型我也是困惑了，不明白所以。（作者先用輻射與未照射的外泌體處理細(xì)胞后再照射，用過照射的外泌體處理的細(xì)胞顯示出克隆形成能力增強(qiáng)）
GW4869在非輻射時(shí)對(duì)腫瘤增殖沒有影響，在輻射后對(duì)腫瘤增殖起到抑制作用？我覺得不加GW4869也會(huì)得到這個(gè)結(jié)果。讓我越來越看不懂了。自此，得到結(jié)果：從垂死的腫瘤細(xì)胞中提取的外切體可以促進(jìn)輻射后的細(xì)胞存活。WTF.
體外表型做完了，是不是該做體內(nèi)了，安排上裸鼠上場，PDX模型建立，分組：對(duì)照組CTRL,照射組rad，照射+GW4869,單用GW4869；得出結(jié)論：照射后的PDX腫瘤在滯后期后顯示加速再繁殖，即使來自不同患者的腫瘤之間存在微小差異。令人驚訝的是，當(dāng)PDX小鼠同時(shí)接受GW4869治療時(shí)，腫瘤再生長顯著減慢，并延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間(圖I)。此外，更多的Ki-67+細(xì)胞駐留在受照射的腫瘤中，同時(shí)GW4869治療顯著減少，表明輻照致死腫瘤細(xì)胞外泌體促進(jìn)了腫瘤增殖啊。我的天，一會(huì)抑制，一會(huì)促進(jìn)，我已暈，眾人別扶，我還能看，你這個(gè)P1、P2怎么來的，怎么界定的??！全文沒有說明，WTF，我裂開了。總之，體內(nèi)，體外表型做完了。接下來該干什么了呢？機(jī)制?。?！我覺得不等我看完我將四分五裂
還記得剛開始說到的干細(xì)胞嗎？感覺作者還沒扯到這個(gè)方面上來啊，沒有老八干不了的，奧利給，干就完了。輻射后腫瘤細(xì)胞都茍延殘喘，總用一些頑強(qiáng)的活了下來，并且繼承了前輩的衣缽將至死不渝的精神發(fā)揚(yáng)光大，下面，一起來找找這些TRCs。作者猜測可能就是這些個(gè)TRCs接受了這些垂死細(xì)胞釋放的外泌體，完成了上述的抑制后增殖的過程。這聽著感覺TRCs對(duì)放療不敏感啊。怎么識(shí)別這些細(xì)胞呢？還是找差異，把照射和沒照射的拿出來對(duì)比一下干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)84個(gè)靶基因中的62個(gè)被鑒定為上調(diào)。特別地，11個(gè)統(tǒng)計(jì)上顯著改變的基因中有10個(gè)上調(diào)，在照射后的PANC-1細(xì)胞中，CD24+細(xì)胞和CD326(ESA)+細(xì)胞的比例顯著上調(diào),顯示腫瘤干細(xì)胞特性。
輻射后ALDH1A1的表達(dá)顯著上調(diào)，ALDEFLOUR?實(shí)驗(yàn)顯示，放射后存活的癌細(xì)胞和原代胰腺腫瘤細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞的比例顯著升高qPCR分析和Westernblot表明，ALDH1A1在照射后的胰腺癌細(xì)胞和PDX腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。免疫組化(IHC)染色進(jìn)一步顯示照射后PDX腫瘤組織中ALDH1A1+細(xì)胞高度富集。然而，GW4869顯著抑制了ALDH1A1+細(xì)胞的積累。你細(xì)品，又是這個(gè)P1、P2。也就驗(yàn)證了ALDH1A1+細(xì)胞就是要找的TRCs。
怎么來標(biāo)記這個(gè)ALDH1A1+細(xì)胞和ALDH1A1-細(xì)胞呢，作者構(gòu)建了一個(gè)條件表達(dá)系統(tǒng)，就是加入4-羥基三苯氧胺(4OHT)誘導(dǎo)后ALDH1A1的表達(dá)，顯示藍(lán)色，不表達(dá)的的時(shí)候顯示紅色，這個(gè)思路不錯(cuò)，需要的可以拿去哈！具體制作的病毒，也是公司構(gòu)建的吧！
效果怎么樣，照就完了。祭出我40米的砍刀削一下你15米的鉛筆。
不適說過有個(gè)外泌體釋放抑制劑嗎？他是不是應(yīng)該出來表示一下存在。安排上
這么頑強(qiáng)的TRCs在隊(duì)友快要嗝屁的時(shí)候是怎么含淚舔盒的，一起培養(yǎng)看看吧。讓我看到了腫瘤細(xì)胞的無私。一瞬間覺得它們并沒有這么可惡了。
好了，以上說了腫瘤細(xì)胞怎么存活下來的，以及鑒定了在后期增殖過程中起重要核心作用的TRCs（我覺得就是干細(xì)胞?。?，下面就看看這些細(xì)胞也受到輻射損傷后自己是怎么在隊(duì)友幫助下修復(fù)的了?；A(chǔ)知識(shí)科普一下，在X線照射后，主要損傷的還是GENE，會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配、斷裂和S=S等情況，所以，這些活下來的腫瘤細(xì)胞必定需要DNA修復(fù)，驗(yàn)證一波走起。在PDX上觀察一下細(xì)胞形態(tài)，看到?jīng)]有，它們活過來了?？梢?TRCs細(xì)胞也未能幸免。但是加入GW4869后即使50天了，DNA損傷還是存在的。說明了外泌體在DNA損傷修復(fù)過程中是起到保護(hù)作用的。
在體外也看看剛才構(gòu)建的那個(gè)細(xì)胞系什么情況。是不是很直觀，GFP+細(xì)胞能夠很快從DNA損傷中恢復(fù)過來。來自受輻射死亡的腫瘤細(xì)胞的外體顯著加速了受輻射細(xì)胞中γ-H2A.X和pATM的清除。文末會(huì)科普一下彗星拖尾實(shí)驗(yàn)（一中觀察DNA損傷的實(shí)驗(yàn)）
以上說了外泌體參與到了TRCs的修復(fù)過程中，到底是哪種成分呢，它又起到什么作用呢？來來來，瓜子、板凳準(zhǔn)備好。提到外泌體，它其中的貨物最常見的也是最有可能的就是miRNA，這種非編碼RNA在翻譯、轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)作用很廣泛（罩不住人家多?。Ｗ髡哂诌M(jìn)行了外泌體miRNA-seq?？纯?，還是找差異表達(dá)的基因。
發(fā)現(xiàn)兩個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的miRNAs，miR-196b-5p和miR-194-5p，在瀕臨死亡的腫瘤細(xì)胞來源的外體中顯著上調(diào)，作為p53誘導(dǎo)的miRNA，miR-194可能參與基因組穩(wěn)定。那還說啥，就你了。這下來又是一通驗(yàn)證，是不是存在（CM外泌體，血漿外泌體），預(yù)測結(jié)合蛋白，功能驗(yàn)證（gain or loss of function），miRNA的對(duì)照組是MIMICs。這就沒外泌體什么事了。以后實(shí)驗(yàn)在靶細(xì)胞中進(jìn)行就行了。
別慌，從頭再說一次，不是說垂死的細(xì)胞外泌體存進(jìn)了G1/S期阻滯嗎？還有剛才的DNA修復(fù)，作者可沒忘，又回頭驗(yàn)證了一遍。這個(gè)克隆形成，我真是無法理解了，我要裂開了。這個(gè)只能解釋成只有在輻射條件下這個(gè)microRNA才對(duì)克隆形成又促進(jìn)作用。不輻射的時(shí)候它就抑制腫瘤增殖。我此刻一臉問號(hào)，WTF。
還記得找TRCs構(gòu)建的條件表達(dá)基因嗎？這次作者又故技重施，構(gòu)建了多西環(huán)素誘導(dǎo)miR-194-5P表達(dá)。我就不上圖了，其實(shí)原理都一樣，結(jié)果也和上面的一樣。那個(gè)DNA損傷的WB上一個(gè)吧。
這下microRNA功能也驗(yàn)證了，該找靶點(diǎn)了吧。這個(gè)還是需要網(wǎng)站預(yù)測，一般都是多找?guī)讉€(gè)預(yù)測網(wǎng)站，然后取個(gè)交集，作者再把靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，找到了E2F3參與了細(xì)胞周期。然后雙別熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明E2F3是miR-194-5p的直接靶點(diǎn)，又驗(yàn)證了E2F3在DNA損傷中的作用、細(xì)胞周期中的作用、以及在克隆形成中的作用（這個(gè)克隆形成此刻應(yīng)該能體會(huì)到我的怒火）以上都是一般套路和其前面說的一樣。不上圖了。驗(yàn)證了microRNA表達(dá)上調(diào)，抑制了E2F3的表達(dá)，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。E2F3過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)展和EDU的摻入。DNA損傷后，一定不能使增殖加速，要不然細(xì)胞只有死路一條。
先前的研究確認(rèn)HMGA2和E2F3是胰腺癌八個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)中心中的兩個(gè)[27]。HMGA2與E2F3在胰腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，出人意料的是，據(jù)報(bào)道，具有癌前干化能力的癌基因HMGA2與miR-194相互作用。我們發(fā)現(xiàn)HMGA2負(fù)調(diào)控miR194-5p的表達(dá)。經(jīng)tcga數(shù)據(jù)庫分析，hmgA2和miR-194-5p在胰腺癌中也呈負(fù)相關(guān)（這也是坐著神來之筆啊，真是好文自有天助，這要是不說誰能想到HMGA2這個(gè)玩意兒），作者又把剛才micro那個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的東西又又又拿過來驗(yàn)證了一下（經(jīng)費(fèi)在燃燒?。?。
HMGA2的過表達(dá)促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的增殖，與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中HMGA2的表達(dá)顯著上調(diào)。ALDH1A1+胰腺癌細(xì)胞也顯示HMGA2表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)，HMGA2過表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出更多的干細(xì)胞樣特征，如較高比例的ALDH+細(xì)胞。TRCs中富集的HMGA2促進(jìn)了它們的干性和癌癥進(jìn)展，但對(duì)輻射后的TRCs的存活和恢復(fù)有潛在的不利作用，而來自垂死的腫瘤細(xì)胞的外體miR-194-5p在放射治療下瞬時(shí)逆轉(zhuǎn)了HMGA2的作用，以保護(hù)TRCs。
再總結(jié)一下：microRNA-194-5P抑制了克隆形成能力，促進(jìn)了腫瘤在輻射后的DNA損傷修復(fù)，但是HMGA2可以促進(jìn)克隆形成，但是在輻射后HMGA2的功能受到的短暫抑制，而后又恢復(fù)了。就這邏輯能力，我是佩服的五體投地。我似乎還忘了些什么啊，對(duì)了PGE2。作者，來坐下來繼續(xù)聊啊。PGE2這是一種脂質(zhì)啊，作者作了ELISA定量看看CM中的含量變化，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長，PGE2也是增多的。PCR也驗(yàn)證了，為毛未輻射 的也多了啊。
PGE2產(chǎn)生的關(guān)鍵酶COX-2是不是也隨著變化了，前面不是說外泌體照射后增多了嗎，那相關(guān)的酶是不是也有這種時(shí)間依賴性變化，驗(yàn)證。
然后，你明白的，作者真是錢多不怕花，gain and loss of function of PGE2.這里就簡單多了，PGE2可以直接買，抑制的話就用COX-2抑制劑就行，得出結(jié)論，PGE2促進(jìn)腫瘤生長。但是不影響外泌體蛋白表達(dá)。這樣說PGE2還有助于增強(qiáng)腫瘤放射治療的敏感性?。∥沂遣皇前l(fā)現(xiàn)了什么不可告人的秘密。（這個(gè)塞來昔布并沒有抑制COX-2?。∽髡?，有必要解釋一下?。?/p>
綜上所述，這些結(jié)果表明，垂死的腫瘤細(xì)胞釋放的外切體和PGE2介導(dǎo)了腫瘤再增殖的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中外切體miR-194-5p首先抑制細(xì)胞增殖以促進(jìn)TRCs的恢復(fù)，然后PGE2促進(jìn)恢復(fù)的TRCs的加速增殖。下面又一個(gè)大拿上場了——阿司匹林，作者以前發(fā)現(xiàn)阿司匹林具有抑制腫瘤的作用，這次也安排上，不僅抑制輻射腫瘤生長，也能抑制外泌體分泌，然后抑制了外泌體介導(dǎo)的那些作用：逆轉(zhuǎn)輻射細(xì)胞周期改變，DNA損傷加重、PGE2釋放減少、抑制了輻射細(xì)胞克隆形成能力。
至此，文章結(jié)束了。感覺讀下來是多么不易。什么HMGA2、PGE2、miR-194-5p、E2F3、阿司匹林，那個(gè)作用強(qiáng)，那個(gè)作用弱，哪個(gè)先，哪個(gè)后，我已經(jīng)理不清了。喝口水，緩緩。
補(bǔ)充下小知識(shí)：彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）也被稱為單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一種在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷的技術(shù)。當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性 DNA 損傷因子誘發(fā)細(xì)胞 DNA 鏈斷裂時(shí)，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA 以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。電泳過程中，如果DNA沒有損傷，則將停留在原位，染色后呈圓形的熒光團(tuán)，無拖尾出現(xiàn)。如果DNA受損，斷裂的碎片進(jìn)入到凝膠中，在電場的作用下，DNA碎片離開原位向陽極遷移，形成拖尾。DNA受損越嚴(yán)重，斷裂越多，產(chǎn)生的碎片就越多、越小，則向陽極遷移的DNA碎片量就越多，遷移距離也越長，熒光染色后就能看見“彗星”樣尾長并且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
