Save Time with Transient Plant Leaf Transformations
與植物一起工作并不總是一個(gè)耗時(shí)的過程。雖然在組織培養(yǎng)中培育轉(zhuǎn)基因毛狀根需要半年時(shí)間，而培育轉(zhuǎn)基因植物可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間，但一個(gè)短暫的植物葉片轉(zhuǎn)化過程可以為植物生物學(xué)家節(jié)省一些時(shí)間(…)。實(shí)際上是幾個(gè)月。
在李帕森實(shí)驗(yàn)室，我們正在研究癌癥治療藥物長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春新堿的生產(chǎn)是如何在藥用植物中得到控制的。長(zhǎng)春花(圖1)我們研究的最終目標(biāo)是提高它們?cè)谥参锘蛑参锝M織培養(yǎng)中的產(chǎn)量。
玫瑰C.不是一個(gè)典型的有機(jī)體，例如擬南芥或者煙草。研究基因功能玫瑰C.由于方法的可用性而受到很大的限制。感染發(fā)根農(nóng)桿菌可用于組織培養(yǎng)中發(fā)育穩(wěn)定的毛狀根系。這種方法常用于玫瑰C.但在毛狀根中不能研究光合活性組織的過程，因?yàn)楦腥鄙俟δ苋~綠體和葉特異性細(xì)胞類型。轉(zhuǎn)基因毛狀根的發(fā)育至少需要6個(gè)月的時(shí)間。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物所需的時(shí)間更長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度更大，效率更低，而且往往無法復(fù)制。在建立轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)或植物之前，我們的瞬時(shí)表達(dá)方法使我們能夠快速篩選和研究轉(zhuǎn)錄因子候選物和生物合成途徑中的基因調(diào)控。
為什么植物科學(xué)家會(huì)做短暫的葉片轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展是非模式生物普遍存在的問題。因此，瞬態(tài)方法通常是研究基因功能的首選方法，因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)可以在幾天到幾周內(nèi)完成，而不是幾個(gè)月到幾年。在植物科學(xué)中，“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”通常指的是一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系或植物不能從轉(zhuǎn)化的組織中再生?；蚬δ芡ǔＭㄟ^瞬時(shí)沉默和/或在植物中過度表達(dá)感興趣的基因來研究。
基因沉默的常用方法
病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)是一種利用病毒和植物轉(zhuǎn)錄后機(jī)制來沉默感興趣基因的短暫技術(shù)(Unver和Budak，2009年)。這種方法適用于玫瑰C..
一種常見的過表達(dá)基因的方法
在像這樣的植物中擬南芥和煙草，農(nóng)桿菌滲透到葉片中是一種簡(jiǎn)單而有效的表達(dá)基因和評(píng)價(jià)其功能的方法。本質(zhì)上農(nóng)桿菌包含一個(gè)帶有T-DNA(轉(zhuǎn)移-DNA)區(qū)域的質(zhì)粒。在感染過程中，這個(gè)T-DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)移到植物中.在實(shí)驗(yàn)室里，我們可以利用這一自然過程，用我們感興趣的基因或報(bào)告基因替換T-DNA區(qū)域上的基因，從而跟蹤轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)。在短暫的葉片轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌該菌株與葉片組織接觸，并將帶有感興趣基因的T-DNA區(qū)域轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。但為了C.?玫瑰,?農(nóng)桿菌滲透到葉子里不起作用。,因?yàn)槿~子有蠟質(zhì)，很難滲透。
我們最近克服了這個(gè)問題玫瑰C.通過與幼苗一起工作并優(yōu)化過渡轉(zhuǎn)化過程的其他幾個(gè)方面(Mortensen等人，2019年)。我們的方法也可以為其他物種的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)提供一些有用的指導(dǎo)。
開發(fā)瞬態(tài)葉轉(zhuǎn)換方法時(shí)應(yīng)考慮的問題農(nóng)桿菌:
如果您是這個(gè)領(lǐng)域的新手，以下是您第一次短暫的葉轉(zhuǎn)換的有用提示：
檢查您的種族是否有可用的工作協(xié)議。
這會(huì)幫你節(jié)省很多時(shí)間。別再發(fā)明輪子了。
測(cè)定不同葉齡
通常較年輕的葉子工作得更好。并不是每一片葉子都同樣容易發(fā)生短暫的轉(zhuǎn)化。
選擇好的報(bào)告基因
有很多偉大的報(bào)告基因可用的和您選擇的取決于您的實(shí)驗(yàn)(de Ruijter等人，2003年)。例如，我們對(duì)GUS基因進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)換，以確定轉(zhuǎn)化是否成功。一旦我們走上正軌，我們就轉(zhuǎn)向熒光素酶，更容易量化不同治療方法對(duì)轉(zhuǎn)化成功的影響。下面是一些報(bào)告基因的例子。
GUS基因(β-葡萄糖醛酸酶)用組織化學(xué)GUS染色是一個(gè)非常有用的視覺報(bào)告(圖2)。GUS酶切割一個(gè)底物，然后形成藍(lán)色沉淀。GUS通常是建立一個(gè)新的轉(zhuǎn)換協(xié)議的首選，因?yàn)樗梢院苋菀椎仫@示哪些組織已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。但是要注意：檢查你組織中的GUS樣活動(dòng)。使用農(nóng)桿菌缺乏GUS基因，因?yàn)橹参锟梢?a target="_blank">內(nèi)源性Gus樣活性(Hu等人，1990年)。我們通常使用PSB 161-PL2_pSB 90_2x35S：：GUS：：TMA以確認(rèn)轉(zhuǎn)化成功。
熒光素酶是一種很好的定量報(bào)告，并利用底物產(chǎn)生生物發(fā)光。熒光素酶通常比GUS具有更短的mRNA和蛋白半衰期，因此是測(cè)定啟動(dòng)子活性的好時(shí)機(jī)記者。有用的積極控制可包括：PSB 96-PL2_pSB 90_2x35S：：Fluc-I：：TNO?&?PSB 166-PL2_pSB 90_TMAs：：rLUC-I：：PMA.
熒光蛋白(FP，例如GFP)可以以多種方式使用。通常，F(xiàn)P與感興趣的蛋白質(zhì)融合，以闡明你感興趣的蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。
從Lee-Parsons實(shí)驗(yàn)室找到所有的質(zhì)粒。
不同入滲方法試驗(yàn)
共育(Li等人，2009年)：農(nóng)桿菌與你的葉子是一個(gè)非常容易的轉(zhuǎn)化方法，但可能是低效的許多物種。更有效的是注射器或真空滲透。
注射器滲透(d‘Aoust等人，2009年)：通常用沒有針頭的注射器注射農(nóng)桿菌通過氣孔培養(yǎng)進(jìn)入葉的背面(下表面)。這是一種簡(jiǎn)單容易實(shí)現(xiàn)的技術(shù)。成功可能因?qū)嶒?yàn)者而異。
真空滲透(Mortensen等人，2019年)：葉子或整株植物被放置在農(nóng)桿菌溶液和真空用真空鐘或干燥器。成功的浸潤通?？梢酝ㄟ^組織的下沉來觀察(見圖3)。這種方法可能是最可伸縮的方法。
把你的植物移到黑暗里在改造前16小時(shí).
我們通常在轉(zhuǎn)化前16小時(shí)將我們的植物轉(zhuǎn)移到黑暗中，在轉(zhuǎn)化后的黑暗中再給它們留下兩天的時(shí)間。
使用內(nèi)含子
植物促進(jìn)劑可以被識(shí)別或泄漏在農(nóng)桿菌。這對(duì)于報(bào)告基因來說尤其有問題，因?yàn)槟赡軙?huì)從農(nóng)桿菌，但不是植物。例如，我們看到了古斯具有CaMV35S啟動(dòng)子的基因農(nóng)桿菌。通過使用內(nèi)含子可以很容易地避免這種情況，這些內(nèi)含子將從植物的轉(zhuǎn)錄本中刪除，但不能從植物中刪除。農(nóng)桿菌.
試驗(yàn)不同農(nóng)桿菌菌株
我們用被解除的武器根癌農(nóng)桿菌GV 3101菌株(PMP 90)，對(duì)我們很有效。
使用工作良好的矢量系統(tǒng)
這使得您可以快速地組裝向量并測(cè)試不同的想法。我們是超級(jí)粉絲基于金門的MoClo系統(tǒng).?上面的博客文章中提到的向量已經(jīng)準(zhǔn)備好使用向量，但是使用MoClo系統(tǒng)，您可以輕松、快速地創(chuàng)建自定義向量。有關(guān)植物的MoClo的更多信息，請(qǐng)查看以下內(nèi)容采訪尼古拉贊助人，分享MoClo植物試劑盒.
對(duì)我們來說，瞬時(shí)葉片轉(zhuǎn)化對(duì)篩選候選基因和加快研究是很有幫助的。當(dāng)然，暫時(shí)的葉轉(zhuǎn)換還有更多，但是我們希望這些技巧可以幫助您開始工作。一旦你在你的實(shí)驗(yàn)室建立了一個(gè)良好的協(xié)議，它就可以成為你的研究的有力工具。歡迎在下面的評(píng)論中添加更多的技巧和經(jīng)驗(yàn)。
References
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Mortensen, Samuel, et al. "EASI transformation: An efficient transient expression method for analyzing gene function in Catharanthus roseus seedlings."?Frontiers in plant science?10 (2019). PubMed?PMID: 31263474. PubMed Central?PMCID: PMC6585625.
Unver, Turgay, and Hikmet Budak. "Virus-induced gene silencing, a post transcriptional gene silencing method."International journal of plant genomics?2009 (2009). PubMed?PMID: 19547658. PubMed Central?PMCID: PMC2699436
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