主要內(nèi)容：
1. 核磁共振和質(zhì)譜的概述
2. 核磁共振和質(zhì)譜的技術(shù)比較
1.核磁共振和質(zhì)譜概述
1.1?代謝組學(xué)技術(shù)概述
代謝組學(xué)分析可分為靶向分析和非靶向分析。非靶向分析側(cè)重于樣本中代謝物總量（“指紋”）的代謝譜分析。?
核磁共振通常用于代謝組學(xué)指紋圖譜研究。??
靶向代謝組學(xué)方法側(cè)重于定量和鑒定所選代謝物，例如涉及特定代謝途徑的代謝物或其他作為藥物服用或食物攝入直接產(chǎn)物的代謝物。在靶向代謝物分析中，通常已知正在研究的代謝物，并且可以調(diào)整樣品的制備以減少相關(guān)代謝物干擾的影響。??
基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法通常是靶向分析的最佳方法。
質(zhì)譜分析方法和儀器的不斷發(fā)展提供了一種高度特異的分析工具，它可以提供化學(xué)信息，如用于確定元素公式的準(zhǔn)確質(zhì)量、同位素分布模式，通過(guò)母離子和碎片離子的特性進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，利用光譜匹配法對(duì)真實(shí)化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒別，并比較不同化學(xué)品在混合樣品中的濃度水平。??
與核磁共振波譜相比，質(zhì)譜在分析次級(jí)代謝物方面具有優(yōu)勢(shì)。此外，不同的質(zhì)譜技術(shù)提供了一系列可應(yīng)用的工作原理，例如不同的電離技術(shù)，因此可能增加代謝物檢測(cè)到的數(shù)量。
核磁共振波譜的高重復(fù)性以及非破壞性和非侵入性是核磁共振在代謝組學(xué)研究中的重要優(yōu)勢(shì)。??
此外，核磁共振可用于體內(nèi)研究，稱(chēng)為磁共振波譜（MRS）；任何通過(guò)核磁共振波譜研究的體外代謝物途徑都可通過(guò)使用MRS進(jìn)行體內(nèi)研究?；诤舜殴舱竦拇x組學(xué)方法涉及同位素標(biāo)記的核，如13C和15N，可用于獲得有用的信息，如關(guān)于生物系統(tǒng)中代謝物的平衡和通過(guò)代謝途徑監(jiān)測(cè)化合物的流動(dòng)。??
在短短幾分鐘內(nèi)即可同時(shí)檢測(cè)到大量代謝物，這進(jìn)一步說(shuō)明了核磁共振波譜在代謝組學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)。例如，一個(gè)質(zhì)子核磁共振譜可以量化人類(lèi)尿液樣本中大約100種代謝物，這就提供了一個(gè)給定時(shí)間點(diǎn)人類(lèi)代謝狀況的全面圖像。此外，高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS）核磁共振波譜可用于完整組織樣品的研究，從而無(wú)需提取等預(yù)處理步驟即可檢測(cè)組織中存在的代謝物。
沒(méi)有一個(gè)單一的分析平臺(tái)能夠?qū)悠分械乃蟹肿舆M(jìn)行完全的定量和鑒定。因此，除了一維和二維核磁共振實(shí)驗(yàn)外，還需要采用不同的電離方法、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等技術(shù)，以最大限度地鑒定復(fù)雜樣品中的不同代謝物。??
NMR、GC-MS、直接流動(dòng)注射質(zhì)譜（DFI/LC-MS/MS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）和高效液相色譜（HPLC）的結(jié)合應(yīng)用等等。
?2.?核磁共振和質(zhì)譜技術(shù)比較
2.1?NMR
核磁共振波譜主要用于化學(xué)鑒定和量化給定樣品的化學(xué)成分。核磁共振波譜的應(yīng)用不僅限于液體樣品，還可用于固體、氣相和組織樣品。此外，核磁共振除了在分子鑒定和結(jié)構(gòu)解析中的主要應(yīng)用外，還可以用來(lái)研究分子的物理化學(xué)性質(zhì)，如電子密度和分子動(dòng)力學(xué)。因此，核磁共振已成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要工具，因?yàn)樗寡芯咳藛T能夠在生物條件下研究分子結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)。此外，核磁共振波譜已被廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)、高分子和藥物發(fā)現(xiàn)等研究領(lǐng)域。??
核磁共振波譜已被認(rèn)為是代謝組學(xué)應(yīng)用中最相關(guān)的方法之一，例如，作為一種對(duì)多種人類(lèi)疾病的強(qiáng)有力的診斷方法。低靈敏度是核磁共振在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用的固有缺點(diǎn)和首要挑戰(zhàn)。相關(guān)機(jī)械的不斷發(fā)展，如更高的磁場(chǎng)強(qiáng)度、低溫冷卻探針和微探針，都顯著提高了核磁共振的靈敏度。動(dòng)態(tài)核極化（DNP）方法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種有效的提高核磁共振成像和光譜靈敏度的方法。
2.1.1?高分辨魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS）核磁共振波譜
核磁共振波譜的應(yīng)用不局限于液體和固體樣品，而是通過(guò)高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS）核磁共振波譜擴(kuò)展到完整的組織樣品。以54.74°“魔角”的角度旋轉(zhuǎn)樣品到磁場(chǎng)中并高速旋轉(zhuǎn)，可以獲得與溶液態(tài)核磁共振譜相當(dāng)?shù)姆直媛实墓庾V。??
使用這種方法，組織樣品的化學(xué)成分可以在不需要提取等預(yù)處理步驟的情況下自動(dòng)檢測(cè)。??
在基于核磁共振的代謝組學(xué)方法中，該技術(shù)有助于提供生物流體的代謝剖面與特定組織的組織學(xué)之間的相關(guān)性。因此，HRMAS核磁共振波譜已經(jīng)被用來(lái)研究包括腦、腎、肝和睪丸組織在內(nèi)的小的完整組織樣品的代謝平衡。HRMAS作為鑒別典型腦膜瘤和良性組織的一種有潛力的診斷工具，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于腦膜瘤活檢。
2.1.2?一維（1D）核磁共振波譜
盡管核磁共振波譜已被用于許多具有不同可檢測(cè)核的多維實(shí)驗(yàn)，但一維質(zhì)子核磁共振仍然是最有用的技術(shù)，特別是在代謝組學(xué)研究中。然而，由于化學(xué)位移的范圍很窄（10ppm），重疊信號(hào)的1H NMR譜通常會(huì)持續(xù)存在，這導(dǎo)致譜的比對(duì)不確定。??
圖中顯示了由正丙醇和正丁醇兩個(gè)簡(jiǎn)單分子組成的樣品的質(zhì)子核磁共振譜。從圖中可以看出，正丙醇和正丁醇的甲基的信號(hào)在0.92ppm處都是重疊信號(hào)，不能用簡(jiǎn)單的1D核磁共振譜來(lái)分辨。此外，在1.55ppm下也獲得了重疊信號(hào)。這些重疊的信號(hào)與來(lái)自?xún)蓚€(gè)分子的-CH2-基團(tuán)有關(guān)，但是根據(jù)簡(jiǎn)單的1D質(zhì)子核磁共振譜，不可能將特定的信號(hào)歸因于特定的分子。
其他原子核如碳和氮的核磁共振化學(xué)位移范圍更廣，但也帶來(lái)了其他限制。例如，一維磷（31P）核磁共振譜具有31P核天然豐度100%，化學(xué)位移范圍寬，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。因此，31P NMR譜通常被用來(lái)研究與能量代謝有關(guān)的磷脂和代謝物。然而，大多數(shù)代謝物不含磷這一事實(shí)代表了31P NMR譜的主要局限性。通常，一維碳（13C）核磁共振譜的譜寬大于200ppm，導(dǎo)致譜色散變寬。13C NMR波譜在分子鑒定和結(jié)構(gòu)解釋方面具有特別的信息。然而，13C 核的天然豐度低（1.1%）和低靈敏度阻礙了該同位素在核磁共振代謝組學(xué)中的應(yīng)用。為了增強(qiáng)13C NMR信號(hào)，人們開(kāi)發(fā)了不同的NMR方法。例如，極化轉(zhuǎn)移無(wú)失真增強(qiáng)（DEPT）是提高NMR譜靈敏度的一種有效手段，利用DEPT可以將13C信號(hào)強(qiáng)度提高4倍。DEPT核磁共振實(shí)驗(yàn)也有助于區(qū)分CH2和（CH，CH3），例如DEPT-135的13C NMR譜產(chǎn)生負(fù)強(qiáng)度的CH2峰和正強(qiáng)度的CH和CH3峰（下圖）。
15NNMR譜在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中非常有用，包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的研究，以及蛋白質(zhì)-金屬配位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體相互作用的研究。然而，由于15N的自然豐度較低，只有0.37%和較低的敏感性，這一方法在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用前景不大。
2.1.3?二維（2D）核磁共振波譜
二維（2D）核磁共振波譜可以用來(lái)克服質(zhì)子1D核磁共振波譜中重疊共振的問(wèn)題，從而比1D方法能夠檢測(cè)和比對(duì)更多的代謝物。二維核磁共振波譜是基于空間自旋耦合或鍵耦合，前者主要用于結(jié)構(gòu)解釋?zhuān)笳哂糜诜肿予b定。??
通過(guò)鍵相關(guān)，核磁共振譜分為兩大類(lèi)：同核譜，主要是（1H-1H）如相關(guān)譜（COSY）和全相關(guān)譜（TOCSY），異核譜（1H-13C）。??
其他二維方法，如二維J分辨NMR譜（J-Res）和擴(kuò)散有序譜（DOSY）已用于基于NMR的代謝組學(xué)研究。采用COSY和DOSY相結(jié)合的方法，研究了肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型心肌組織的代謝變化。包括單量子相干（HSQC）、異核多量子關(guān)聯(lián)（HMQC）和異核多鍵關(guān)聯(lián)（HMBC）的異核二維實(shí)驗(yàn)在二維上具有較高的分辨率，主要使用（13C），并被用于代謝產(chǎn)物的識(shí)別和鑒定。
盡管二維核磁共振實(shí)驗(yàn)改善了核磁共振信號(hào)的分散性，但增加的采集時(shí)間、數(shù)據(jù)大小和數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性，限制了這種方法的頻繁使用。然而，核磁共振儀器的不斷發(fā)展和新的更快的核磁共振信號(hào)采集和數(shù)據(jù)處理方法正導(dǎo)致代謝組學(xué)研究中更多地使用二維技術(shù)。
2.1.4?相關(guān)光譜學(xué)（COSY）
COSY是二維同核相關(guān)光譜的第一項(xiàng)技術(shù)，多年來(lái)被用于分子鑒定和結(jié)構(gòu)解釋。COSY在代謝組學(xué)研究中得到了應(yīng)用，因?yàn)樗靡嬗谙鄬?duì)較短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可以在幾分鐘內(nèi)運(yùn)行2D譜，提供的信息比從1DNMR譜獲得的信息多得多。??
最簡(jiǎn)單的COSY脈沖序列包括一個(gè)90°RF脈沖，然后是演化時(shí)間（t1），然后是第二個(gè)90°脈沖，最后是測(cè)量周期（t2）。COSY譜主要由同核（1H-1H）相關(guān)譜組成，其中2D譜中的交叉峰通過(guò)核對(duì)之間的鍵耦合來(lái)指示。??
交叉峰是通過(guò)兩核間的鍵磁化傳遞來(lái)表示的。這為鑒定由許多分子組成的樣品中屬于同一分子的峰提供了強(qiáng)有力的工具，生物樣品中的代謝物也是如此。由于通過(guò)鍵關(guān)聯(lián)只發(fā)生在同一分子內(nèi)，COSY核磁共振譜已被廣泛應(yīng)用于基于核磁共振的代謝組學(xué)應(yīng)用中。
上圖顯示了二維COSY核磁共振譜，耦合質(zhì)子之間的相關(guān)性可用于分配核磁共振信號(hào)和識(shí)別相應(yīng)的分子。然而，對(duì)于多個(gè)重疊信號(hào)，2DCOSY不夠強(qiáng)大，不允許分配單個(gè)信號(hào)。其他二維核磁共振實(shí)驗(yàn)，如全相關(guān)譜（TOCSY），可用于輔助信號(hào)分配。
2.1.5?總相關(guān)光譜學(xué)（TCOSY）
TOCSY或HOHAHA（同核Hartmann-Hahn）是COSY的一種類(lèi)似方法，其中給定核的化學(xué)位移（如H）與原子自旋系統(tǒng)（未斷開(kāi)的耦合鏈）中相同化合物的其他Hs的化學(xué)位移相關(guān)。與COSY相似，COSY能觀察到相鄰碳原子中通過(guò)標(biāo)量耦合連接的原子對(duì)（質(zhì)子）之間的相互關(guān)系，TOCSY能譜不僅顯示了直接耦合的質(zhì)子的交叉峰，也顯示了通過(guò)耦合鏈連接的質(zhì)子的交叉峰。?
例如，如果質(zhì)子A與質(zhì)子B耦合，質(zhì)子B與質(zhì)子C耦合，COSY譜只表示A與B的耦合，而TOCSY譜則顯示A與B和C的耦合。??
下圖顯示了TOCSY（藍(lán)色）和COSY譜（紅色）的疊加圖：可以觀察到更多的藍(lán)色峰，它們代表與同一分子（正丙醇和正丁醇）相關(guān)的質(zhì)子信號(hào)耦合的每個(gè)質(zhì)子信號(hào)。這表明TOCSY譜可以用來(lái)分辨屬于不同分子的重疊峰。
下圖示出了上頁(yè)圖的擴(kuò)展區(qū)域。很明顯，正丙醇峰可以通過(guò)簡(jiǎn)單地檢測(cè)共享四個(gè)互相關(guān)峰（正丁醇，綠色箭頭）的信號(hào)與僅共享三個(gè)互相關(guān)峰（正丙醇，黑色箭頭）的信號(hào)進(jìn)行分辨。通過(guò)在繪圖軸上繪制從交叉峰到1D光譜的投影來(lái)完成峰值的比對(duì)（下圖）。將綠色箭頭（丁醇）與3.584ppm處的信號(hào)相連的箭頭投影證實(shí)了該峰值指的是丁醇，而不是丙醇；將1.564ppm處的信號(hào)與黑色箭頭相關(guān)聯(lián)的第二個(gè)投影證實(shí)了該峰值對(duì)應(yīng)于丙醇分子（下圖）。確認(rèn)一個(gè)峰為丙醇，另一個(gè)峰為丁醇，就足以利用TOCSY譜完成兩個(gè)分子的所有信號(hào)比對(duì)（下圖）。1H NMR信號(hào)的分配可與其它2DNMR技術(shù)相結(jié)合，如異核相關(guān)譜。這將有助于分配其他核信號(hào)，如碳核磁共振譜。
?2.1.6?異核單量子相關(guān)光譜（HSQC）
鍵關(guān)聯(lián)也可用于兩種不同類(lèi)型的原子核（通常為1H，13C或15N）之間的關(guān)聯(lián)，這兩種原子核由一個(gè)鍵分離。例如，1H-13C的HSQC光譜協(xié)調(diào)了質(zhì)子和相應(yīng)的結(jié)合碳的化學(xué)位移，因此每對(duì)耦合原子只能獲得一個(gè)交叉峰。因此，HSQC為信號(hào)比對(duì)，特別是重疊質(zhì)子信號(hào)的比對(duì)提供了一種特別有用的方法。
下圖顯示了CDCL3中正丁醇和正丙醇混合物的1H-13CHSQC光譜。結(jié)果表明，HSQC在解決重疊質(zhì)子信號(hào)方面是有效的。例如，擴(kuò)展區(qū)（A）在0.91ppm處分辨重疊的質(zhì)子信號(hào)。此外，HSQC譜可用于質(zhì)子和碳核磁共振譜的歸屬。
HSQC也是一種減少低靈敏度和低自然豐度原子核（如13C和15N）實(shí)驗(yàn)時(shí)間的有效技術(shù)，而從較敏感的原子核I（通常1h）轉(zhuǎn)移到較不敏感的原子核（如13C和15N）的磁化強(qiáng)度是最重要的技術(shù)之一，在蛋白質(zhì)信號(hào)比對(duì)中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，由于核磁共振信號(hào)的比對(duì)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的前提。二維多量子關(guān)聯(lián)譜（HMQC）是一種類(lèi)似于HSQC譜的二維異核相關(guān)NMR方法，它提供的信息與HSQC譜相同，但使用的方法不同。HSQC和HMQC都被用于基于NMR的代謝組學(xué)研究，HSQC被認(rèn)為在大分子如蛋白質(zhì)方面更為優(yōu)越。
異核多鍵相關(guān)（HMBC）是一種二維異核相關(guān)技術(shù)，它將兩種不同類(lèi)型的原子核（即13C和1H）的化學(xué)位移聯(lián)系起來(lái)，這些原子核被兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵分開(kāi)。??
一個(gè)核的化學(xué)位移，如1H，通常在直接測(cè)量的維度（F2）中檢測(cè)到，另一個(gè)核的化學(xué)位移，如13C（X-核或異核）在間接維度中記錄，如圖所示。
在這種方法中，使用低通濾波來(lái)消除與單鍵相互作用相對(duì)應(yīng)的單鍵關(guān)聯(lián)，即所謂的“單量子相干”。例如，（1H–13C）HMBC消除了單一的C–H鍵關(guān)聯(lián)，同時(shí)將H與C的化學(xué)位移關(guān)聯(lián)起來(lái)，當(dāng)H與C被兩個(gè)或三個(gè)鍵分離時(shí)，在某些情況下，甚至與更遙遠(yuǎn)的鍵分離時(shí)。因此，（1H-13C）HMBC通常用于比對(duì)季碳和羰基化合物的信號(hào)。
HMBC與HSQC或HMQC的結(jié)合為信號(hào)的比對(duì)提供了一種強(qiáng)有力的方法。下圖顯示了HMQC（紅色）和HMBC（藍(lán)色），七個(gè)紅色交叉峰與正丙醇和正丁醇中的七個(gè)碳有關(guān)，十六個(gè)藍(lán)色交叉峰與長(zhǎng)鍵相關(guān)相互作用有關(guān)。該圖展示了結(jié)合和整合二維核磁共振實(shí)驗(yàn)信息進(jìn)行光譜分配的能力。HMQC譜可用于區(qū)分重疊信號(hào)和分離信號(hào)。
例如，在0.92ppm左右觀察到的質(zhì)子多重波信號(hào)與10.07和13.79ppm處的兩個(gè)碳峰相耦合，證實(shí)質(zhì)子核磁共振信號(hào)確實(shí)是兩個(gè)重疊的信號(hào)。類(lèi)似地，約1.55ppm的質(zhì)子倍增與兩個(gè)碳信號(hào)耦合，而1.37、3.54和3.58ppm的剩余質(zhì)子信號(hào)中的每一個(gè)僅與一個(gè)碳信號(hào)耦合。
此外，HMBC和HSQC光譜可用于正丁醇和正丙醇的分離和分配。例如，連接25.67ppm的碳信號(hào)和1.564的質(zhì)子共振的碳HSQC交叉峰（紅色）與兩個(gè)HMBC交叉峰（黑色箭頭）對(duì)齊，因此，將三個(gè)峰分配給正丙醇分子，而HSQC（紅色）與另外三個(gè)藍(lán)色HMBC交叉峰對(duì)齊，將這些峰分配給正丁醇分子（綠色箭頭；見(jiàn)下圖）。
下圖展示了正丁醇化學(xué)鍵連接的示例模型，該模型可以通過(guò)二維實(shí)驗(yàn)對(duì)同核關(guān)聯(lián)和異核關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。
2.2?質(zhì)譜（MS）
質(zhì)譜（MS）是主要用于鑒定未知化合物和量化樣品中的已知分子。至于核磁共振和X射線，它也可用于結(jié)構(gòu)解釋和研究所研究材料的化學(xué)性質(zhì)。由于其高靈敏度和高選擇性，為生物樣品等混合樣品中代謝物的分析提供了重要的分析平臺(tái)。此外，質(zhì)譜還可以檢測(cè)不含質(zhì)子或碳的離子，如金屬離子。然而，沒(méi)有一種MS方法適合于檢測(cè)所有種類(lèi)的代謝產(chǎn)物，因此必須使用一種以上的方法進(jìn)行全面的代謝譜分析。
質(zhì)譜儀具有不同的電離源和可用于檢測(cè)不同種類(lèi)分子的質(zhì)譜分析儀。例如，使用GC-MS的優(yōu)點(diǎn)包括高分離效率和可重復(fù)的保留時(shí)間，可在不同實(shí)驗(yàn)室之間交換，以使用保留時(shí)間作為標(biāo)記的保留指數(shù)概念進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。??
然而，GC-MS固有的局限性在于它只檢測(cè)揮發(fā)性化合物或可衍生成揮發(fā)性的化合物。
此外，MS不能檢測(cè)到所有的代謝物，因?yàn)橛行┐x物不能用某些電離方法電離。??
MS檢測(cè)器的動(dòng)態(tài)范圍仍然只有3-4個(gè)數(shù)量級(jí)，而代謝產(chǎn)物濃度的動(dòng)態(tài)范圍通常要大得多，沒(méi)有一種檢測(cè)器能夠檢測(cè)出所有的代謝產(chǎn)物。在生物樣品的代謝驗(yàn)證中，一個(gè)普遍的挑戰(zhàn)是許多代謝物尚未完全鑒定。
質(zhì)譜法能檢測(cè)到的代謝物的數(shù)量和種類(lèi)取決于電離模式的選擇。沒(méi)有一種單一的電離方法可以涵蓋所有的代謝物類(lèi)別，如極性、非極性中性和離子性。因此，應(yīng)獨(dú)立使用不同的電離方法，以最大限度地增加檢測(cè)到的代謝物數(shù)量。??
例如，在LC-MS分析中，正模式的電噴霧電離（ESI）是最常見(jiàn)的模式，可以有效地電離大范圍的中型極性分子，而負(fù)電離模式對(duì)于某些代謝物類(lèi)別（如碳水化合物和有機(jī)酸）更為強(qiáng)大。??
據(jù)報(bào)道，大氣壓化學(xué)電離（APCI）和電噴霧電離（ESI）都能使紅細(xì)胞代謝組的覆蓋率增加34%。?
據(jù)報(bào)道，通過(guò)使用一套不同的GC-MS和LC-MS互補(bǔ)方法，可在血液樣本的定向分析方法中檢測(cè)多達(dá)100–500種代謝物，并可在指紋模式中檢測(cè)約600–1000種代謝物。??
需要注意的是，LC-MS和GC-MS中的代謝產(chǎn)物鑒定策略不同，通常只檢測(cè)分子離子，需要額外的MS/MS實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得代謝產(chǎn)物的特性和結(jié)構(gòu)信息。
2.2.1 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）
LC-MS包括兩種強(qiáng)大的分析工具：高效液相色譜法（高效液相色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)高壓液相色譜法）和質(zhì)譜法。當(dāng)組合時(shí)，LC-MS用于分離、鑒定和定量混合樣品中的分子。??
高效液相色譜技術(shù)首先根據(jù)分子大小、電荷、極性和對(duì)其他分子的依附性等不同的物理和化學(xué)性質(zhì)來(lái)分離分子。至于其他色譜技術(shù)，高效液相色譜由固定相和流動(dòng)相組成。??
固定相包括使用硅膠等材料，這些材料根據(jù)分子大小在不同程度上減緩分子的移動(dòng)，從而允許根據(jù)大小差異分離分子。??
流動(dòng)相包括含有樣品混合物的溶液，并通過(guò)分子分離發(fā)生的固定相（色譜柱）。??
柱層析法可用于從混合物中純化單個(gè)化合物。不同的樣品需要不同的色譜柱、蛋白質(zhì)和肽樣品，例如，需要不同的色譜柱，不同于代謝組學(xué)研究中典型的小分子樣品所需的色譜柱。一旦分析物被分離，它們就會(huì)通過(guò)質(zhì)譜分析儀，在那里根據(jù)質(zhì)荷比進(jìn)行檢測(cè)，每條合成線的強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于每個(gè)分子的相對(duì)濃度。
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其分離和檢測(cè)多種分子的能力，可能是應(yīng)用最廣泛的質(zhì)譜技術(shù)，特別是在生物科學(xué)中。LC-MS是進(jìn)行大多數(shù)代謝物分析研究的一種非常適用的工具，可以獲得高靈敏度的定量和結(jié)構(gòu)信息。不同的分離方法可以用來(lái)分離不同種類(lèi)的代謝物。??
反相梯度色譜法（RP）已成為L(zhǎng)C-MS研究中最常用的用于全局代謝產(chǎn)物分析的分離方法。然而，這不是極性和/或離子物種的最合適方法，其中包括許多重要的代謝物（有機(jī)酸或氨基酸）。這些代謝物是生化途徑中非常重要的組成部分，它們的評(píng)價(jià)可能對(duì)檢測(cè)關(guān)鍵代謝狀態(tài)，如先天性代謝錯(cuò)誤和代謝綜合征有重要意義。
親水相互作用色譜法（HILIC）是一種可用于極性代謝物離子化的方法，可增加代謝物檢測(cè)的廣度。為了最大限度地覆蓋代謝物，可以對(duì)樣品進(jìn)行兩次分析，要么分別使用RP和HILIC，要么在HILIC和RP-LC的“正交”組合中使用二維分析的柱切換方法。盡管RP和HILIC聯(lián)合使用是許多代謝物的首選電離方法，但這種方法并不涵蓋生物樣品（如尿液）代謝物極性的整個(gè)范圍。??
因此，建議采用其他電離方法，如正、負(fù)電噴霧電離（ESI）模式和大氣壓化學(xué)電離（APCI），以便最大限度地檢測(cè)生物樣品中的不同代謝物?？紤]到所有這些可能性，需要以八種不同模式（八次獨(dú)立運(yùn)行）進(jìn)行分析，以全面分析代謝物。這些組合拓寬了LC-MS在代謝組學(xué)中的應(yīng)用，事實(shí)上，無(wú)論是靶向代謝組學(xué)分析還是非靶向代謝組學(xué)分析，都越來(lái)越多地使用不同的LC-MS方法進(jìn)行。
2.2.2? 氣相色譜-質(zhì)譜 GC-MS
GC-MS是一種新的分析揮發(fā)性分子的工具，由于現(xiàn)代毛細(xì)管氣相色譜具有高分辨率和可重復(fù)性的色譜分離，這些特點(diǎn)使其非常適合復(fù)雜代謝混合物的分析。與LC-MS類(lèi)似，GC-MS由氣相色譜和質(zhì)譜兩種強(qiáng)大的分析方法組成。這些方法共同提供了一種最強(qiáng)大的分離方法，可用于提供揮發(fā)性化合物的定性和定量信息。??
樣品首先通過(guò)氣相色譜儀，在氣相色譜儀中對(duì)混合物中的揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行高分辨率分離。氣相色譜裝置主要由色譜柱組成，基本上是一個(gè)長(zhǎng)度從小于2米到60米或以上不等的管，直徑從10厘米到30厘米不等。
不同類(lèi)型的色譜柱，如填充柱和毛細(xì)管柱，用于分離不同類(lèi)型的樣品。填充管可以是不銹鋼、玻璃或熔融石英制成，通常以線圈的形式形成，以便在大約250℃的溫度下放入高溫實(shí)驗(yàn)用的烘箱中。惰性氣體（如氦氣）吹過(guò)色譜柱；當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱時(shí)，它蒸發(fā)了，揮發(fā)性分子被氦推動(dòng)穿過(guò)柱。一開(kāi)始，所有的分子一起移動(dòng)，但根據(jù)分子量和大小，其中某些分子的移動(dòng)速度比其他分子慢。較小的分子比較大的分子移動(dòng)得更快，當(dāng)它們通過(guò)色譜柱時(shí)，分子繼續(xù)彼此分離，最終以不同的組分形式從色譜柱中出現(xiàn)，從而提供了一種有效的分離方法。
當(dāng)分子離開(kāi)氣相色譜柱時(shí)，它們被引入質(zhì)譜，在那里用電離方法（如電子束）電離。由特定分子形成的離子將取決于該分子的性質(zhì)，并且該分子的電離分子和離子片段都可用于根據(jù)質(zhì)荷比在分子水平上區(qū)分和識(shí)別混合物的組分。此外，可以通過(guò)測(cè)量峰的絕對(duì)強(qiáng)度來(lái)獲得關(guān)于混合物成分的定性信息，其中最高峰被取為表示100%豐度，并用作其他峰的參考。??
因此，GC-MS是分析揮發(fā)性代謝物的首選分析工具，已被用于代謝組學(xué)研究的不同領(lǐng)域，包括植物代謝組學(xué)和篩選先天代謝錯(cuò)誤。
除了建立良好的數(shù)據(jù)庫(kù)，如費(fèi)恩（Fiehn）代謝組學(xué)庫(kù)，GC-MS提供了良好的重現(xiàn)性和高度可重復(fù)的片段，因此為鑒定代謝物提供了有力的工具。其他優(yōu)點(diǎn)包括高靈敏度和分辨率、低成本和易于使用的儀器。氣相色譜-質(zhì)譜分析的主要局限性在于僅限于小分子揮發(fā)性物質(zhì)，這意味著該方法在全球代謝譜研究中的應(yīng)用有限。??
氣相色譜-質(zhì)譜分析的主要局限性在于僅限于小分子揮發(fā)性物質(zhì)，這意味著該方法在全球代謝譜研究中的應(yīng)用有限。再者，生物樣品的制備，如生物體液，可能會(huì)耗費(fèi)時(shí)間和重復(fù)性，這可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。在電離過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)其他問(wèn)題，如產(chǎn)物的形成和降解。此外，在衍生化反應(yīng)中，非揮發(fā)性代謝物可以轉(zhuǎn)化為不同形式的衍生物，產(chǎn)生碎片，從而使同一母體代謝物的不同形式共存。在分析代謝物含量具有高度可變性的真實(shí)樣品（如人類(lèi)尿液）時(shí)，根據(jù)代謝物的不同性質(zhì)，衍生化可能以不同的轉(zhuǎn)化率發(fā)生，因此潛在地顯著影響再現(xiàn)性和總體結(jié)果。為了克服諸如不精確量化的問(wèn)題，標(biāo)準(zhǔn)化合物可用于衍生標(biāo)準(zhǔn)化合物和數(shù)據(jù)校正過(guò)程，例如標(biāo)準(zhǔn)化。
為了產(chǎn)生可重復(fù)的質(zhì)譜和高度可轉(zhuǎn)移的EI-MS譜庫(kù)，建議使用70ev的標(biāo)準(zhǔn)MS電子電離能，以便通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)匹配（如NIST和FiehnLib）識(shí)別化合物。
