PD-L2 based immune signature confers poor prognosis in HNSCC

基于PD-L2的免疫特征賦予HNSCC較差的預(yù)后

發(fā)表期刊：Oncoimmunology

發(fā)表日期：2021 Aug 4

影響因子：8.110

DOI:? 10.1080/2162402X.2021.1947569

一、背景

????????2018年全球有超過80萬個(gè)頭頸部腫瘤新病例的報(bào)道。每年有超過40萬患者死于該疾病，其中約90%的患者為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）亞型。約19-46%的HNSCC患者被診斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，15-50%的患者在接受標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。

????????越來越多的證據(jù)表明，人類癌癥（包括晚期HNSCC）的腫瘤微環(huán)境中存在免疫失調(diào)。PD-1，也被稱為CD279，是一種重要的免疫抑制檢查點(diǎn)分子，主要表達(dá)于活化的B細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞和APCs。通過靶向PD-1/PD-L1軸阻斷免疫檢查點(diǎn)可以改善復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性（R/M）HNSCC患者的生存率。PD-L2是PD-1的另一個(gè)配體，在某些功能上與PD-L1相似，主要影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

二、材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

1）59名接受手術(shù)的HNSCC患者

2）HNSCC標(biāo)本：包括61個(gè)原發(fā)性HNSCC組織、8個(gè)轉(zhuǎn)移性HNSCC組織和11個(gè)正常舌組織

2.實(shí)驗(yàn)流程

1）免疫組化中的樣品去糖基化

2）生存樹分析模型：使用最小深度和可變重要性（VIMP）建立了生存樹分析（STA）模型；采用Kaplan-Meier分析法對結(jié)點(diǎn)進(jìn)行評估

3）體內(nèi)異種移植腫瘤模式：小鼠實(shí)驗(yàn)

4）循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離、TILs的分離和分析

5）單細(xì)胞測序：GSE163872

6）通路分析和基因組富集分析：基因組富集分析（GSEA）用于分析scRNA-seq數(shù)據(jù)

7）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Wilcoxon配對t檢驗(yàn)、McNemar或chi-squared檢驗(yàn)和ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行分析；多變量Cox回歸模型和Kaplan-Meier分析被用來評估生存率

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

01、PD-L2在大多數(shù)HNSCC患者中都有表達(dá)

????????研究共納入59名HNSCC患者，大多數(shù)患者是男性（69.49%）和吸煙者（61.02%），其中28例口腔原發(fā)性腫瘤。記錄了48例（81.4%）死亡，中位隨訪時(shí)間為45個(gè)月。所有腫瘤標(biāo)本用于分析PD-L2和PD-L1表達(dá)的患者在診斷時(shí)均接受手術(shù)，未接受任何新輔助治療，包括化療或放療。

????????IHC染色顯示PD-L2在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)（圖1a），此外，PD-L2水平與AJCC分期密切相關(guān)（圖1b）。與非轉(zhuǎn)移性腫瘤相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤樣本中的瘤內(nèi)PD-L2+細(xì)胞密度明顯較高（圖1c）。59份標(biāo)本中有15份檢測到PD-L1的表達(dá)，PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞的染色密度和強(qiáng)度明顯弱于PD-L2陽性腫瘤細(xì)胞，腫瘤中PD-L1和PD-L2的表達(dá)密切相關(guān)。此外，61.36%的腫瘤標(biāo)本在PD-L1陰性的樣本中為PD-L2陽性（圖1d）。與只表達(dá)PD-L1的標(biāo)本相比，同時(shí)表達(dá)PD-L2和PD-L1的標(biāo)本以及只表達(dá)PD-L2的標(biāo)本更為常見。這些結(jié)果表明，HNSCC樣本的瘤內(nèi)PD-L2水平高于PD-L1，表明在沒有PD-L1的情況下，PD-L2在免疫抑制中起著代償作用。

????????43個(gè)HNSCC標(biāo)本在基質(zhì)中呈PD-L2陽性。腫瘤中PD-L2陽性細(xì)胞的密度高于基質(zhì)中的密度，但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1e）。另外，PD-L1在基質(zhì)中的表達(dá)也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤表達(dá)PD-L1和PD-L2在基質(zhì)中的表達(dá)強(qiáng)度沒有關(guān)聯(lián)。

????????作者進(jìn)一步驗(yàn)證了PD-L2在HNSCC標(biāo)本中的表達(dá)（圖1f），其中包括61個(gè)原發(fā)性HNSCC組織、8個(gè)轉(zhuǎn)移性HNSCC組織和11個(gè)正常舌組織。86.96%的腫瘤標(biāo)本為PD-L2陽性，與原發(fā)腫瘤和非腫瘤組織相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤表現(xiàn)出更高的PD-L2水平（圖1g）。

圖1 PD-L2在HNSCC標(biāo)本中的表達(dá)和分布

02、HNSCC標(biāo)本的PD-L2表達(dá)和臨床病理學(xué)特征

????????PD-L2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC分期和分化等級成正相關(guān)。在單變量分析中，原發(fā)部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化等級和臨床分期（AJCC 2018）、瘤內(nèi)PD-L2、CD3、CD8和基質(zhì)CD3與預(yù)后不良有關(guān)。62.5%的腫瘤在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯示中度或高度的PD-L2染色。PD-L2和CD8的狀態(tài)是腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。

03、PD-1的表達(dá)與PD-L2的表達(dá)有關(guān)

????????PD-L2通過與PD-1陽性TILs結(jié)合，在HNSCC的免疫逃逸中起著重要作用。38.98%的腫瘤標(biāo)本為PD-1陽性TILs。PD-1陽性細(xì)胞顯示出較高的CD8表達(dá)水平，PD-1+TILs與CD8+TILs呈正相關(guān)（圖2a）。值得注意的是，PD-1+TILs的中位數(shù)與PD-L2表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)（圖2b）。

????????觀察到四種不同的腫瘤微環(huán)境：I型為適應(yīng)性免疫抵抗，32%，有TIL和PD-L1表達(dá)的病例中觀察到；II型為免疫忽視 ，22%，同時(shí)缺乏TIL、PD-L1或PD-L2的病例中觀察到；III型為內(nèi)在誘導(dǎo)，39%，有PD-L1和PD-L2表達(dá)且TIL缺乏的病例中觀察到；IV型，耐受，7%，有TIL且缺乏PD-L1表達(dá)的病例中觀察到（圖2c）。此外，還經(jīng)常觀察到PD-L2和PD-1的存在而PD-L1的缺失（圖2d）。

圖2 HNSCC中PD-1、PD-L1和PD-L2表達(dá)的異質(zhì)性

04、PD-L2在小鼠異種移植腫瘤模型的免疫抑制中起關(guān)鍵作用

????????作者建立了一個(gè)C3H免疫能力小鼠模型，并研究了PD-L2在PD-L1存在的情況下的潛在作用（圖3a）。PD-1或PD-L2的單克隆抗體（mAb）表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，而PD-L1 mAb對腫瘤生長的抑制作用有限（圖3b, c）。PD-L2 mAb組的TILs中活化的CD8+IFN-γ+ T細(xì)胞數(shù)量是PD-L1 mAb組的兩倍（圖3d）。在CD335+NK和NK1.1+NKT細(xì)胞數(shù)量中也發(fā)現(xiàn)類似的模式（圖3e，f）。與PD-L1 mAb組相比，PD-L2 mAb組的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性升高，如粒酶B的免疫染色所示（圖3g）。這些結(jié)果表明，用PD-1或PD-L2的mAb治療可以極大地誘導(dǎo)免疫細(xì)胞在腫瘤中的浸潤。此外，代表腫瘤高轉(zhuǎn)移能力的CTCs在PD-1 mAb和PD-L2mAb組都明顯減少（圖3h）。

圖3 PD-L2在體內(nèi)的免疫抑制中起著決定性作用

????????隨著上述PD-L2在HNSCC中的抗腫瘤免疫作用的證明，作者進(jìn)一步研究了免疫相關(guān)基因的表達(dá)與PD-L2之間的相關(guān)性（圖4a）。在腫瘤體中，CD8+T細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞和FOXP3+Tregs的密度大大低于基質(zhì)中的密度（圖4b）。在瘤內(nèi)和基質(zhì)區(qū)域，CD8+或CD3+T細(xì)胞的數(shù)量明顯高于FOXP3+ Tregs的數(shù)量（圖4b）。FOXP3+Tregs、CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量在腫瘤體中呈正相關(guān)（圖4c）。在腫瘤體中，PD-L2+腫瘤細(xì)胞的密度與CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、FOXP3+Tregs（圖4d）之間有正相關(guān)關(guān)系。然而，基質(zhì)PD-L2與CD3、CD8和FOXP3之間沒有明顯關(guān)聯(lián)。因此，PD-L2與腫瘤細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。

圖4 HNSCC的免疫標(biāo)志物表達(dá)

05、預(yù)測HNSCC的OS的預(yù)測模型

????????作者驗(yàn)證了瘤內(nèi)PD-L2的高表達(dá)具有較短的OS（圖5a）。樣本根據(jù)CD3（圖4e）、CD8（圖4e）和FOXP3（圖4e）的表達(dá)被分為兩組，與OS沒有直接關(guān)系。作者假設(shè)免疫細(xì)胞可能由于腫瘤和基質(zhì)的表達(dá)而對OS產(chǎn)生不同的影響。數(shù)據(jù)顯示，CD3、PD-1和CD8的表達(dá)至少部分參與了OS（圖5a）。評估具有不同生物標(biāo)志物表達(dá)的T細(xì)胞亞群可能是預(yù)測HNSCC OS的更準(zhǔn)確的預(yù)后標(biāo)志。為了選擇與生存有關(guān)的變量，本研究STA模型中包括了瘤內(nèi)PD-L2和瘤內(nèi)/基質(zhì)CD3、PD-1、FOXP3和CD8的表達(dá)。

????????作者發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)CD3、CD8和PD-1水平對OS有明顯影響。PD-L2是重要性分析中最具影響力的變量。雖然基質(zhì)PD-1、基質(zhì)CD8以及瘤內(nèi)和基質(zhì)FOXP3水平的VIMP評分為-0.0013、-0.0022、0.0011和-0.0026，但它們的最大值都比最小深度的臨界值（0.9308）高；因此，它們被排除在STA模型之外（圖5b）。

????????本研究確定了六個(gè)節(jié)點(diǎn)，可以描述HNSCC或目前隊(duì)列中的預(yù)后特征。攜帶瘤內(nèi)PD-L2低基質(zhì)CD3高的患者的預(yù)后標(biāo)志與72個(gè)月的最佳中位OS有關(guān)，而最差的生存發(fā)生在第4個(gè)節(jié)點(diǎn)，中位OS為10個(gè)月（瘤內(nèi)PD-L2高瘤內(nèi)CD3低瘤內(nèi)CD8低）（圖5c）。值得注意的是，與瘤內(nèi)PD-L2高瘤內(nèi)CD3低瘤內(nèi)CD8低特征的患者相比，瘤內(nèi)PD-L2低基質(zhì)CD3高特征的患者的預(yù)后指數(shù)預(yù)測的OS更長（圖5d）。

圖5 基于PD-L2的免疫特征與HNSCC患者的生存期有關(guān)

06、PD-L2與細(xì)胞因子IL-6有關(guān)

????????為了研究PD-L2與其他因素之間的關(guān)聯(lián)，作者使用scRNA-seq分析了來自兩名HNSCC患者的PD-L2的表達(dá)（圖6a）。根據(jù)細(xì)胞的全局表達(dá)模式將其劃分為初步的集群，并通過特定的標(biāo)記基因?qū)⒓鹤⑨尀榘┘?xì)胞、肌細(xì)胞、癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞、正常成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。為了更好地分析癌細(xì)胞的異質(zhì)性，作者進(jìn)一步確定了癌細(xì)胞集群的子集群，癌細(xì)胞被進(jìn)一步劃分為六個(gè)集群，發(fā)現(xiàn)表達(dá)PD-L2高表達(dá)的細(xì)胞在集群2中被富集（圖6b）。

????????為了進(jìn)一步了解PD-L2表達(dá)在臨床中的作用，首先使用似然比檢驗(yàn)來確定與其他集群相比，PD-L2富集的集群2中的差異表達(dá)基因（DEGs），確定了819個(gè)上調(diào)的DEGs，發(fā)現(xiàn)在這819個(gè)DEGs中包含了幾個(gè)與預(yù)后不良有關(guān)的基因。根據(jù)GSEA分析，PD-L2高表達(dá)的相關(guān)特征在 "HALLMARK_HYPOXIA"、"HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE "和"HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB "組中富集。為了證實(shí)這一結(jié)果，進(jìn)行了GSVA分析，以估計(jì)和比較每個(gè)簇的癌癥標(biāo)志相關(guān)狀態(tài)。與其他集群相比，集群2顯示屬于 "HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION"、"HALLMARK_HYPOXIA "和"HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE "組的基因表達(dá)較高（圖6c）。特別是與Th2細(xì)胞因子反應(yīng)有關(guān)的IL-6被確認(rèn)為重疊基因，表明它與PD-L2高表達(dá)有關(guān)（圖6d）。

????????為了進(jìn)一步驗(yàn)證PD-L2和IL-6之間的潛在相互作用，作者對59個(gè)人類HNSCC樣本進(jìn)行了IHC。共有59.32%的HNSCC標(biāo)本為IL-6陽性，包括27.12%的弱染色，20.34%的中度染色和11.86%的強(qiáng)染色（圖6e）。IL-6高表達(dá)的患者OS較差（圖6f），IL-6水平與PD-L2水平呈正相關(guān)（圖6g）。

????????作者進(jìn)一步調(diào)查了它與FOXP3、CD8和CD3的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IL-6的表達(dá)與腫瘤中的CD8細(xì)胞呈正相關(guān)（圖6g），提示PD-L2水平高的患者的生存不良是由較高的IL-6分泌引起。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，作者評估了PD-L2在體外對IL-6刺激的表達(dá)。PD-L2的mRNA和蛋白水平都因IL-6處理而明顯升高（圖6h，i）。這些結(jié)果表明，TH2相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6有助于HNSCC中PD-L2的異常表達(dá)。

圖6 PD-L2的表達(dá)與細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)有關(guān)

四、結(jié)論

????????作者定義了一個(gè)基于PD-L2的免疫特征，可以在HNSCC患者的隊(duì)列中區(qū)分HNSCC的不同亞型的生存結(jié)果。強(qiáng)調(diào)PD-L2是一個(gè)很有前途的免疫檢查點(diǎn)目標(biāo)，并證明其在HNSCC中的預(yù)后價(jià)值。本研究還為在輔助治療中使用抗IL6療法提供了依據(jù)，以改善PD-L2水平高的HNSCC患者的免疫治療方法。