16S rDNA是細菌分類學(xué)研究中最常用的“分子鐘”，總長約 1540 bp，其中包含9個可變區(qū)（Variable region）和10個保守區(qū)（Constant region）?？勺儏^(qū)因菌種不同而異，且變異程度與細菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。通過檢測16S rDNA可變區(qū)的序列變異和豐度，可了解環(huán)境樣品中群落多樣性信息，在微生物分類鑒定、微生態(tài)研究等方面起著重要的作用。
平臺比較
集合優(yōu)勢，成本更低
Sanger測序能夠提供接近全長（Full Length, FL）的16S rDNA片段，但該方法成本高且通量較低，難以滿足復(fù)雜環(huán)境研究需求。
以Illumina為代表的二代測序技術(shù)，成本大大降低，更適合大規(guī)模測序；但是受測序長度的限制，往往只能選擇 1-3 個可變區(qū)作為擴增片段（目前常用擴增子片段是V4區(qū)），分類的準(zhǔn)確性和一致性存在問題。
今天的主角是PacBio全長16S rDNA測序。我們來八一八它和其他平臺16S rDNA測序相比主要有哪些優(yōu)勢，以及全長16S rDNA測序還有哪些不完美之處。
表1. 16S rDNA測序在不同測序平臺中的比較
從上面的表格中，我們可以看到，三代測序集合了Sanger測序的讀長優(yōu)勢和二代測序的高通量優(yōu)勢，可用較低的成本獲得16S rDNA全長序列，滿足全長16S rDNA研究需求。
嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐瑐兛赡軙f：單純的平臺優(yōu)勢并不足以說服我們選擇PacBio測序，我們更關(guān)注的是科研價值！那大家一起來看看在實際研究中，PacBio全長16S rDNA測序表現(xiàn)如何呢？
質(zhì)量優(yōu)勢
準(zhǔn)確度99%、重復(fù)性0.96
2016年年初，美國能源部聯(lián)合基因組研究中心發(fā)表在ISME Journal 上的一篇文章對PacBio全長16S rDNA測序和V4測序結(jié)果進行了系統(tǒng)的比對分析[1]
。
研究人員首先選擇含有23個細菌參考基因組的模擬群落來評估PacBio全長16S rDNA測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。通過擴增，得到模擬群落的V4區(qū)和全長16S rDNA區(qū)域，并分別用MiSeq和PacBio測序得到16S rDNA V4區(qū)序列iTags和全長16S rDNA序列PhyloTags；為了檢測PacBio測序的可重復(fù)性，對同一樣品進行了5次重復(fù)性測序。
通過CCS（Circular Consensus Sequencing）測序模式，PhyloTags序列準(zhǔn)確度達到99%；以97%相似性進行OTU分析得到22個OTU（有一個物種含量很低，PhyloTags和V4 iTags中均未得到），與PacBio shotgun（作為參照標(biāo)準(zhǔn)）結(jié)果具有很強的相關(guān)性（如圖1a）。質(zhì)量最好的PhyloTag與對應(yīng)16S rDNA參考序列基因相似度達到99.5%。此外，5個PhyloTags技術(shù)重復(fù)的相關(guān)性非常好，相關(guān)系數(shù)均達到0.96以上（如圖1b）。從模擬群落實驗中可以看到，PhyloTags的數(shù)據(jù)質(zhì)量可與傳統(tǒng)iTags測序質(zhì)量相媲美。
CCS測序模式：PacBio測序中，當(dāng)插入片段(Reads of Insert)< PacBio測序讀長（Polymerase Reads）時，測序模式為CCS，插入片段將會被測到N次，PacBio測序為隨機錯誤模式，N次測序結(jié)果互相校對，準(zhǔn)確率得到極大提升。
分析優(yōu)勢
更準(zhǔn)確的物種分類，更多的物種鑒定
一般環(huán)境的生物復(fù)雜度遠高于以上模擬群體，為了得到更具現(xiàn)實意義的比較結(jié)果，研究人員接下來選擇含有豐富微生物類群的Sakinaw湖水樣本進行分析，在環(huán)境樣本研究中，PhyloTags對復(fù)雜群體分類的優(yōu)勢就凸顯出來了。
? 更準(zhǔn)確的物種分類
研究人員選取8個不同深度的湖水進行采樣，分別對這些樣本進行PhyloTags和V4 iTags分析。結(jié)果表明，V4 iTags數(shù)據(jù)中有0.2%-4.1%的微生物在門水平上無法區(qū)分，而PhyloTags則能在門水平上將這些微生物完全區(qū)分。比較各個深度的PhyloTags和V4 iTags數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在物種多樣性相對較小的淺水區(qū)域，二者得到的群落結(jié)構(gòu)一致性相對較高；而在物種相對豐富的深水區(qū)域，群落結(jié)構(gòu)差異較大。全長16S rDNA檢測到的物種多樣性和生態(tài)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度更高，而且模糊分類更少（如圖2所示）。
圖2. PhyloTags和V4 iTags測序的模糊分類結(jié)果展示（門水平）。黑色柱代表V4 iTags模糊分類序列數(shù)占對應(yīng)門水平序列總數(shù)的百分比；白色柱代表PhyloTags測序結(jié)果模糊分類序列百分比。柱上方的百分?jǐn)?shù)代表對應(yīng)門水平的物種豐度。
為了評估擴增子長度對群體分析的影響，研究人員隨機抽取了Sakinaw樣本中的1818條PacBio FL序列和它們對應(yīng)的二代測序產(chǎn)生的V4區(qū)域序列進行成組比較。結(jié)果表明，在多個實例中，相同的序列對表現(xiàn)出不同的鑒定結(jié)果。產(chǎn)生差異的原因是16S rDNA基因的突變位點在各區(qū)域分布并不均勻，選擇少數(shù)可變區(qū)作為擴增片段可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，高估或低估群落結(jié)構(gòu)多樣性（如圖3a,3b所示）。
? 更多的物種鑒定
全長16S rDNA測序比V4區(qū)測序多鑒定到12%-25%的物種（從種到門水平），更準(zhǔn)確地將微生物與重要的生物化學(xué)循環(huán)相關(guān)聯(lián)。全長16S rDNA測序檢測到了Sakinaw湖水中包括氮循環(huán)和產(chǎn)甲烷循環(huán)中的特定菌Methylocaldum、Nitrospiraceae、Bacillus和Methylotenera，而在V4檢測中，這些菌的豐度被嚴(yán)重低估（如圖4所示）。
綜上所述，PacBio全長16S rDNA測序集合了Sanger測序的讀長優(yōu)勢和二代測序的高通量優(yōu)勢，具有和二代測序相媲美的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，可提供更準(zhǔn)確的物種分類和更多的物種鑒定，在系統(tǒng)發(fā)育、群落鑒定和代謝通路預(yù)測方面都更有優(yōu)勢。
在和MiSeq V4 rDNA測序的PK中，PacBio全長16S rDNA完勝！不過全長16S rDNA測序仍有不完美之處：
不同物種的16S拷貝數(shù)存在差異，全長16S測序仍無法解決拷貝數(shù)不一致導(dǎo)致的豐度差異；
全長16S序列的獲取仍需通過PCR過程，無法完全避免PCR偏好性帶來的系統(tǒng)誤差。
以上兩點是目前16S rDNA測序固有的問題，如果對此非常介意的話，科技君良心推薦您選擇宏基因組學(xué)測序。
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參考文獻：
1.Singer, Esther, et al. "High-resolution phylogenetic microbial community profiling." The ISME journal (2016)
