???????哈嘍大家好，前面小編和大家分享了ATAC-seq數(shù)據(jù)分析的流程，那么，ATAC-seq建庫是否也可以DIY呢？下面就和大家分享一則ATAC-seq建庫的protocol吧~(關(guān)注我們的公眾號并在后臺回復(fù)“ATACseq”可獲取更多ATAC-seq實驗protocol及數(shù)據(jù)分析代碼)
材料試劑：
2ml glass tissue grinder and pestle (Kimble chase, 885301-0002, 885300-0002)
40 μm cell strainer (Fisher, 352340)
Illumina Tagment DNA buffer (Cat#: 15027866) (TD buffer)
Illumina Nextera Tagment DNA enzyme (Cat#: 15027916) (TDE)
NEBNext High-Fidelty 2xPCR Master Mix (NEB M0514S)
10,000 x SYBR Green I (Invitrogen Cat# -7563)
實驗步驟：
1. 將冷凍的組織（5-10 mg）于干冰及液氮中研磨成粉末狀；
2. 將粉碎的組織重懸于1 ml 1×PBS中，4℃，2000g離心3 min；
3. 去上清，于1 ml LB1中重懸；
4. 4℃搖床孵育10 min；
5. 將樣品轉(zhuǎn)移至2 ml 玻璃試管中，輕輕震蕩15次，重新轉(zhuǎn)移至1.5 ml Ep管中；
6. 4℃，2000g離心5 min；
7. 去上清，于1 ml 預(yù)冷PBS中重懸；
8. 過40 uM細(xì)胞篩網(wǎng)；
9. 取10^5個細(xì)胞核（臺盼藍(lán)染色計數(shù)）至新的1.5 mL Ep管中，每樣重復(fù)3次，并用PBS將體積補(bǔ)齊至50ul；
10. 4℃，500g離心 10min；去上清；
11. 每管樣品加入12.5 uL TD緩沖液，10 uL ddH2O以及2.5 uL TDE，轉(zhuǎn)移至PCR管中；
12. PCR儀中37℃孵育1 h。
13. 采用Qiagen MiniElute分離轉(zhuǎn)座酶處理的DNA（此時可于-20℃保存，或進(jìn)行文庫擴(kuò)增）
14. 文庫擴(kuò)增
反應(yīng)體系：
PCR程序：（為減少PCR過程中的GC及片段長度偏差，第一輪PCR設(shè)置5輪擴(kuò)增）
15. qPCR預(yù)測PCR反應(yīng)最適的循環(huán)數(shù)
反應(yīng)體系：
qPCR程序：
16. 最適PCR循環(huán)數(shù)計算方法：
（1）繪制熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)的線性關(guān)系圖；
（2）最大熒光減去最小熒光，得到熒光強(qiáng)度差；
（3）1/4熒光強(qiáng)度差加上最小熒光強(qiáng)度，得到下熒光；1/3熒光強(qiáng)度差加上最小熒光，得到上熒光；
（4）計算下熒光及下熒光對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。
17. 將剩余步驟9中的45 ul PCR產(chǎn)物放回PCR儀中繼續(xù)反應(yīng)：
PCR程序：
18. 用Qiagen MinElute PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增文庫；使用20μl EB洗脫。
19. 凝膠分離和純化：
將純化后的PCR產(chǎn)物裝在2%的EX凝膠上，不加染料，運行6分鐘，標(biāo)記凝膠，采用Qubit收集除60bp primer外的所有產(chǎn)物；膠回收，用EB緩沖液洗脫20ul。
20. 用Qubit測定DNA濃度。
21. 生物分析儀
采用生物分析儀檢測樣品，大小約150-1000bp之間，記錄平均大小、濃度（pg/ul）和摩爾濃度（nmol/l）。用于與后續(xù)測序結(jié)果匹配（檢查峰值形狀是否與測序數(shù)據(jù)相關(guān)）。
怎么樣，是不是很簡單呢？快來試一試吧！
