核心問題解答：條帶越亮（顏色越深）代表蛋白含量越多
在Western Blot（蛋白質(zhì)印跡）實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果通常以條帶的形式呈現(xiàn)。
檢測(cè)原理：通過抗體來(lái)特異性地識(shí)別目標(biāo)蛋白（在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中是泛素化修飾的蛋白）。
信號(hào)強(qiáng)度：抗體上通常連有能發(fā)光或顯色的物質(zhì)。目標(biāo)蛋白的量越多，結(jié)合的抗體就越多，產(chǎn)生的信號(hào)就越強(qiáng)。
圖像呈現(xiàn)：在最終的圖像上，信號(hào)越強(qiáng)，條帶的顏色就越深、越濃（在黑白圖中看起來(lái)就是越黑越亮）。
所以，結(jié)論是：條帶越深/越濃/越亮，代表該位置檢測(cè)到的蛋白含量就越高。
華大測(cè)序膠圖說明：
2025/8/14 補(bǔ)充知識(shí)：
這張圖非常清晰地展示了 Western Blot (WB) 實(shí)驗(yàn)的核心流程。作為一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，它廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中，比如您在研究中可能需要檢測(cè)脅迫條件下某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。
下面我們來(lái)詳細(xì)講解每一步的目的和操作。
- 上樣 (Sample Loading)
目標(biāo): 將處理好的蛋白質(zhì)樣品加入到凝膠的孔中，準(zhǔn)備進(jìn)行分離。
具體操作:
蛋白提取與定量: 首先需要從您的棉花花藥樣品（或其他組織）中提取總蛋白，并用BCA或Bradford等方法測(cè)定蛋白濃度，確保每個(gè)泳道加載的蛋白總量一致或在同一水平，這是后續(xù)進(jìn)行半定量比較的基礎(chǔ)。
樣品制備: 取等量的蛋白，加入SDS-PAGE上樣緩沖液（Loading Buffer）。這個(gè)緩沖液通常是藍(lán)色的，含有SDS（使蛋白變性并帶上均勻負(fù)電荷）、還原劑（如DTT或β-巰基乙醇，用于打開蛋白質(zhì)的二硫鍵）、甘油（增加樣品密度，使其能沉入加樣孔）和溴酚藍(lán)（作為指示劑，用于判斷電泳進(jìn)程）。然后將樣品進(jìn)行加熱（通常是95-100°C，5-10分鐘），使蛋白質(zhì)充分變性，解離成線性肽鏈。
上樣: 用移液槍小心地將處理好的蛋白樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Protein Marker/Ladder）分別注入聚丙烯酰胺凝膠（PAGE gel）的加樣孔中。Marker可以幫助我們判斷目標(biāo)蛋白的分子量大小。
- 電泳 (Electrophoresis)
目標(biāo): 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小，將混合的蛋白質(zhì)樣品分離開。
具體操作:
將凝膠放入充滿電泳緩沖液的電泳槽中，接通電源。
由于SDS使所有蛋白質(zhì)都帶上了均勻的負(fù)電荷，它們會(huì)從負(fù)極向正極移動(dòng)。
凝膠本身是一個(gè)有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的介質(zhì)，分子量小的蛋白質(zhì)在凝膠中受到的阻力小，跑得快、跑得遠(yuǎn)；分子量大的蛋白質(zhì)受到的阻力大，跑得慢、跑得近。
電泳一直進(jìn)行到藍(lán)色的染料指示劑跑到凝膠底部為止。電泳結(jié)束后，凝膠上就形成了一系列按分子量大小排布的、肉眼不可見的蛋白質(zhì)條帶。
- 轉(zhuǎn)膜 (Transfer / Blotting)
目標(biāo): 將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一張固相支持物上，通常是PVDF膜或硝酸纖維素（NC）膜。
具體操作:
制作一個(gè)“三明治”結(jié)構(gòu)：海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF/NC膜-濾紙-海綿墊。關(guān)鍵是確保凝膠和膜緊密貼合，中間不能有氣泡。
將這個(gè)“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中，施加電流。電流方向與凝膠垂直，使帶負(fù)電的蛋白質(zhì)從凝膠中“跑”出來(lái)，并牢固地結(jié)合（吸附）到膜上。這個(gè)過程就像一個(gè)復(fù)印機(jī)，把凝膠上的蛋白圖譜“復(fù)印”到了膜上。
為什么要轉(zhuǎn)膜？ 因?yàn)槟z易碎且后續(xù)抗體難以滲透，而PVDF/NC膜則更堅(jiān)固、便于操作，且能讓抗體更容易地接觸到蛋白。
- 膜封閉 (Blocking)
目標(biāo): “封住”膜上沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的空白區(qū)域，防止后續(xù)加入的抗體非特異性地結(jié)合到膜上，從而降低背景信號(hào)，使結(jié)果更干凈。
具體操作:
將轉(zhuǎn)印好的膜浸入封閉液中，在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一段時(shí)間（通常室溫1-2小時(shí)）。
常用的封閉液是含有脫脂奶粉（通常5%）或牛血清白蛋白 (BSA)（通常3%-5%）的緩沖液（如TBST或PBST）。這些無(wú)害的蛋白質(zhì)會(huì)占據(jù)膜上所有的“空位”。
- 一抗孵育 (Primary Antibody Incubation)
目標(biāo): 用特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）來(lái)“標(biāo)記”出我們感興趣的蛋白。
具體操作:
將封閉好的膜放入稀釋好的一抗溶液中，在搖床上緩慢孵育（通常4°C過夜或室溫1-2小時(shí)）。
一抗會(huì)像精確制導(dǎo)的導(dǎo)彈一樣，在膜上成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)中，只結(jié)合到它的目標(biāo)蛋白上。例如，如果您想檢測(cè)泛素化蛋白，這里使用的一抗就是抗泛素（anti-ubiquitin）抗體。
孵育結(jié)束后，需要用洗滌液（如TBST）多次洗膜，洗去未結(jié)合的、游離的一抗。
- 二抗孵育 (Secondary Antibody Incubation)
目標(biāo): 結(jié)合到一抗上，并攜帶一個(gè)“信號(hào)報(bào)告系統(tǒng)”（通常是酶），用于后續(xù)的信號(hào)檢測(cè)。
具體操作:
將洗滌后的膜放入稀釋好的二抗溶液中，在搖床上室溫孵育1-2小時(shí)。
二抗是用來(lái)識(shí)別一抗的抗體。例如，如果一抗是“兔源”的，那么二抗就必須是“抗兔”的（如羊抗兔IgG）。
二抗上通常偶聯(lián)了辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP)。
孵育結(jié)束后，同樣需要用洗滌液多次、充分地洗膜，洗去游離的二抗，這一步對(duì)減少背景信號(hào)至關(guān)重要。
- 信號(hào)捕獲 (Signal Detection)
目標(biāo): 讓二抗上攜帶的酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生可被檢測(cè)的信號(hào)（如發(fā)光或顯色），從而讓目標(biāo)蛋白的位置“顯現(xiàn)”出來(lái)。
具體操作:
最常用的方法是化學(xué)發(fā)光法 (ECL)。將ECL試劑（包含發(fā)光底物）滴加到膜上，二抗上的HRP酶會(huì)催化底物發(fā)光。
將膜迅速放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中（像一個(gè)高精度的暗箱相機(jī)），捕捉發(fā)出的光，并轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像。您在第一張圖中看到的條帶就是這樣得到的。
- 結(jié)果反饋 (Result Analysis)
目標(biāo): 分析最終得到的圖像，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
具體操作:
定性分析: 觀察在目標(biāo)蛋白的預(yù)期分子量位置（參照Marker）是否存在條帶。有條帶說明蛋白存在，沒有則說明可能不存在或表達(dá)量極低。
半定量分析: 通過軟件（如ImageJ）分析條帶的灰度值（即亮度/深度），可以比較不同樣品中目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。例如，比較高溫處理和常溫對(duì)照組，看條帶是變深了（上調(diào)表達(dá)）還是變淺了（下調(diào)表達(dá)）。
問題：條帶中的marker大小從下到上分子量依次增大，也就是說蛋白是從上端跑到下端是嗎？
是的，完全正確！
這正是SDS-PAGE凝膠電泳的基本原理。
上樣位置 (Loading Position): 蛋白質(zhì)樣品和Marker都是從凝膠頂部的加樣孔 (well) 加入的。
電泳方向 (Running Direction): 在電泳過程中，整個(gè)體系的上方是負(fù)極 (-)，下方是正極 (+)。由于蛋白質(zhì)在經(jīng)過SDS處理后都帶上了均勻的負(fù)電荷，它們會(huì)被上方的負(fù)極排斥，同時(shí)被下方的正極吸引，因此會(huì)集體從上端往下端跑。
分離原理 (Separation Principle): 凝膠就像一個(gè)多孔的篩網(wǎng)。
小分子量蛋白: 體積小，在“篩網(wǎng)”中穿行時(shí)受到的阻力小，所以跑得快，最終會(huì)停留在凝膠的下端。
大分子量蛋白: 體積大，穿行時(shí)受到的阻力大，所以跑得慢，最終只跑了很短的距離，停留在凝膠的上端。
所以，當(dāng)您看到Marker的條帶從下到上分子量依次增大時(shí)，這正好證明了所有蛋白（包括您的樣品蛋白和Marker蛋白）都是從上往下跑，并且在這個(gè)過程中根據(jù)分子量的大小被成功分開了。
簡(jiǎn)單總結(jié)一下：
起點(diǎn): 凝膠上端的加樣孔。
終點(diǎn)方向: 凝膠下端。
跑得最遠(yuǎn)的 (最下方): 分子量最小的蛋白。
跑得最近的 (最上方): 分子量最大的蛋白。
