在發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)對(duì)刺激做出反應(yīng)，在整個(gè)生命過(guò)程中，從一種功能性“狀態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N功能性“狀態(tài)”。處于不同狀態(tài)的細(xì)胞表達(dá)的基因不同，產(chǎn)生蛋白質(zhì)和代謝物的動(dòng)態(tài)重復(fù)序列，從而完成它們的工作。當(dāng)細(xì)胞在不同狀態(tài)間轉(zhuǎn)變時(shí)，會(huì)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄重組的過(guò)程，其中一些基因被沉默，而另一些基因被激活。這些瞬時(shí)狀態(tài)通常難以表征，因?yàn)樵诟€(wěn)定狀態(tài)之間純化細(xì)胞是困難或不可能的。單細(xì)胞RNA-Seq可以使您在不需要純化細(xì)胞的情況下查看這些狀態(tài)。然而，要做到這一點(diǎn)，我們必須確定每個(gè)細(xì)胞的可能狀態(tài)范圍。
今天給大家介紹的是基于Monocle2（目前Monocle已經(jīng)更新至3版本，該版本仍處在開(kāi)發(fā)階段）的擬時(shí)分析。Monocle不是通過(guò)實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞純化成離散狀態(tài)，而是使用一種算法來(lái)學(xué)習(xí)每個(gè)細(xì)胞必須經(jīng)歷的基因表達(dá)變化序列，作為動(dòng)態(tài)生物學(xué)過(guò)程的一部分。一旦它了解了基因表達(dá)變化的整體“軌跡”，Monocle就可以將每個(gè)細(xì)胞放置在軌跡中的適當(dāng)位置。Monocle依靠一種叫做反向圖嵌入的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)來(lái)構(gòu)建單細(xì)胞軌跡（算法參考文獻(xiàn)：Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories）。
Monocle2分析主要基于以下3個(gè)步驟：
1、基因篩選：Monocle尋找以“有趣”(即不只是嘈雜)方式變化的基因，并利用這些基因來(lái)構(gòu)造數(shù)據(jù)。
2、降低維度：一旦選擇了用于細(xì)胞排序的基因，Monocle就會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。
3、pseudotime對(duì)細(xì)胞排序：通過(guò)將表達(dá)數(shù)據(jù)投影到較低維空間，構(gòu)建細(xì)胞間的分化軌跡。
結(jié)果解讀：
圖一：樹(shù)形結(jié)構(gòu)軌跡圖
圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，具有相似細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞被聚到一起，每個(gè)分支點(diǎn)代表著一個(gè)可能的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程決策點(diǎn)（該例圖中有2個(gè)分支點(diǎn)）。左圖為按照細(xì)胞聚類信息進(jìn)行顏色標(biāo)注（如果您已經(jīng)對(duì)每個(gè)cluster進(jìn)行了細(xì)胞鑒定，也可以基于具體的細(xì)胞進(jìn)行著色），右圖為按照分化狀態(tài)（State）進(jìn)行顏色標(biāo)注。
當(dāng)細(xì)胞cluster或state數(shù)量過(guò)多時(shí)，很難看出每個(gè)cluster或狀態(tài)落在樹(shù)上的哪個(gè)位置（如圖一左圖）。因此，我們還可以將每個(gè)cluster或狀態(tài)的軌跡圖分開(kāi)展示，便于對(duì)每個(gè)cluster或狀態(tài)進(jìn)行研究。
圖二：每類細(xì)胞（或State）軌跡圖
確定了分化起點(diǎn)后，Monocle可以模擬出每個(gè)細(xì)胞所處的分化時(shí)間（pseudotime，偽時(shí)間），并尋找隨著分化時(shí)間逐漸升高或降低的基因（圖四為擬時(shí)序變化相關(guān)基因（Top6）表達(dá)分布圖和top50基因熱圖，如果有特別關(guān)注的基因也可以基于關(guān)注的基因進(jìn)行繪制）。
圖三：每個(gè)細(xì)胞分化時(shí)間（pseudotime）軌跡圖
圖四：擬時(shí)序變化相關(guān)基因表達(dá)分布圖和熱圖
