背景介紹
自從進(jìn)入了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展也朝著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的方向在不斷發(fā)展。
我們知道，在臨床應(yīng)用領(lǐng)域，常常需要用更多的樣品量來進(jìn)行研究分析，得到更多的結(jié)果。比如，用幾十上百例的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品來進(jìn)行腫瘤分析。2014年Nature上發(fā)表過一篇文章，做了95例大腸癌的分析，通過label free結(jié)果對95例進(jìn)行分型。與之前的ATGC方法把大腸癌分成四個型比起來，蛋白質(zhì)組學(xué)的方法可以更精準(zhǔn)地分成五個型。這也是蛋白質(zhì)組學(xué)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個很好的應(yīng)用實(shí)例。
（Bing Zhang, Jing Wang, et al, Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer，nature,2014,3,382）
接下來我們分享兩種新方法，都可以實(shí)現(xiàn)簡單、可重復(fù)且自動化的樣品前處理效果。
StageTips
第一種方法最早發(fā)表于2007年，到今年已經(jīng)成立了一家公司，將這種方法發(fā)展出來的裝置很好地商業(yè)化了。
當(dāng)時，整套裝置還需要手工來組裝。不過組裝的方法也非常簡單，根據(jù)上面的圖，分五步走:
第一步:準(zhǔn)備好一張3M的C18過濾膜，一個槍頭，一個平口的針頭和一個長手柄；
第二步+第三步：在3M膜上取出一個小孔的膜，
第四步：將膜捅到EP管里面，用氣把它壓緊了，形成一個小的膜系統(tǒng)。
第五步：取出手柄和針頭，帶膜的槍頭就完成了。
C18過濾膜有脫鹽的效果，可以把蛋白質(zhì)或肽段截留在上面，通過水或BUFFER體系把鹽洗掉，之后再通過有機(jī)相把肽段或蛋白從C18膜上洗脫下來。
除了C18膜，還有很多種類型的膜，比如強(qiáng)陽離子膜、陰離子膜等。大伙兒看看下面這個圖，感受一下這些膜的名字和成分。
這里的柱狀圖是對比不同的膜處理后能鑒定到的肽段的數(shù)量，左圖是肽段水平的鑒定，右圖是蛋白水平的鑒定，差別都不太大（圖里的fr1，2，3是指餾分）。通過這個膜系統(tǒng)，可以進(jìn)行分級分離，也可以進(jìn)行脫鹽。
時間走到2009年，又出現(xiàn)了一種新的FASP（ filter-aided sample preparation）方法。之前的Stagetips只是為了進(jìn)行分級和富集，而FASP可進(jìn)行酶解（文獻(xiàn)見下圖）。
到了2014年，這個團(tuán)隊(duì)又將StageTips和FASP方法結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了所有的實(shí)驗(yàn)都在這個小管子里完成，樣品加入后先清洗，然后還原，清洗，烷基化，再清洗，最后酶解。酶解后的肽段一直留在下圖的“Reaction chamber”里，然后將肽段通過下方的膜脫鹽，洗脫，或者直接通過它進(jìn)行餾分的分離，收集樣品。
四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，用這種裝置做下來，四次都能被重復(fù)的蛋白有92.9%，只有1.6%的蛋白是其中任意一次單獨(dú)鑒定到的，1.5%是其中兩次鑒定到的，4.0%是其中三次鑒定到的。如果我們考慮到這個實(shí)驗(yàn)一共鑒定到了9,667個蛋白（human proteins），在保證了較高的鑒定率的前提下，92.9%的四次重復(fù)率已經(jīng)相當(dāng)不錯了！并且信號強(qiáng)度也比較一致。由于管子體積的限制，這套裝置很適合少量樣品的分析。
該方法已經(jīng)商業(yè)化。2016年Cell Systems上發(fā)表了一篇用這套商業(yè)化的裝置做的血液樣品案例。如下圖，把血液樣品取出來后，直接加到裝備了膜系統(tǒng)的EP管里。通過優(yōu)化整個酶解系統(tǒng)，整個前處理過程2個小時之內(nèi)就能完成，其中裂解與還原烷基化是同時完成的。完成之后通過一個自動化儀器，進(jìn)入質(zhì)譜，經(jīng)過0.5小時的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，以及15分鐘的結(jié)果分析，最后鑒定到了300多個常規(guī)的中高豐度蛋白（這個例子中沒有對血液中的高豐度蛋白進(jìn)行去除）。
同樣的，文章里也對這次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)性評估，見下圖。
從圖上看，鑒定的重復(fù)性特別好，尤其是49種FDA批準(zhǔn)的Biomarkers中，有41種的CV值都小于20%，說明這些biomarkers可以通過該方法可重復(fù)地檢測到。這個方法被認(rèn)為很有希望發(fā)展為高通量樣品處理的方案。
Tips:
CV值：Coefficient of Variation，反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對值。在進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析時，如果變異系數(shù)大于15%~20%，則要考慮該數(shù)據(jù)可能不正常，應(yīng)該剔除 。
以上是該公司的網(wǎng)址，有興趣的小伙伴可以登上去看看。目前最新的進(jìn)展是，重復(fù)性可以到0.99，樣品處理時間縮短到了1個小時，再加上20分鐘的質(zhì)譜分析，總體實(shí)驗(yàn)時間得到了很好地控制，實(shí)現(xiàn)了簡單快速高效且可重復(fù)的要求！我們期待這個方法能早時用到臨床樣品的檢測上。
PCT壓力循環(huán)系統(tǒng)
第二種新方法叫PCT壓力循環(huán)系統(tǒng)。
剛才講到，可以通過壓力差來進(jìn)行樣品的破碎和蛋白的提取。另外，我們知道，在高壓條件下，很多反應(yīng)是會提高效率的，比如說酶解、還原烷基化、樣品裂解等。下面這篇文章通過分析穿刺的樣品（量非常少，大概只有1立方毫米），放到PCT裝置里，通過樣品的處理，還原烷基化，酶解，酶解之后脫鹽，取出，直接進(jìn)行SWATH分析。
我們來看下這種方法的結(jié)果評估。圖示上方的a 圖表明結(jié)果的SD（樣品標(biāo)準(zhǔn)差）都很小，說明檢測結(jié)果很精確；b圖表明漏切的位點(diǎn)也很少.
圖示下方的a圖表明，可重復(fù)性CV值基本上都小于20%，只有其中兩次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中差異大了一點(diǎn)。
文章里用這個方法分析了9對胃癌的癌癥與癌旁組織，然后找到了一組蛋白成為癌癥的潛在標(biāo)志物。
以上是兩種在蛋白質(zhì)臨床檢測方面非常有前途的方法，都實(shí)現(xiàn)了快速、高通量、高重現(xiàn)性，自動化的處理，感興趣的童鞋可以重點(diǎn)關(guān)注一下。
第二講總結(jié)
最后，我們對整個第二講的內(nèi)容進(jìn)行一個小結(jié)，如下圖：
