地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848618322336
閱讀人：劉綿宇

摘要

攜帶PIRA和PirB有毒質(zhì)粒的副溶血弧菌(Vibrio Parhaemolyticus)是引起南美白對(duì)蝦(Litopenaeus Vannamei)急性肝胰腺壞死病(AHPND)的病原，近年來給南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。培育南美白對(duì)蝦抗弧菌親本是有效控制該病發(fā)生的重要途徑。由于基因組選擇在選擇精度和效率方面的優(yōu)勢，基因組選擇有望成為加速抗病性狀遺傳改良的一種可行選擇。本研究以實(shí)際和模擬數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)南美白對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性遺傳力進(jìn)行了估算，并對(duì)南美白對(duì)蝦進(jìn)行GS基因改造的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。蝦對(duì)溶血性弧菌的抵抗力的遺傳力約為0.15-0.24，這表明通過選擇性育種可以實(shí)現(xiàn)遺傳改良。基于真實(shí)數(shù)據(jù)對(duì)GS的后續(xù)分析表明，基因組最佳線性無偏預(yù)測(GBLUP)比傳統(tǒng)的基于系譜的最佳線性無偏預(yù)測(PBLUP)更準(zhǔn)確，生存時(shí)間的預(yù)測精度提高了6.8%，存活狀態(tài)的預(yù)測精度提高了3.5%。同樣，對(duì)于模擬數(shù)據(jù)，與GBLUP相比，生存時(shí)間和二元生存的預(yù)測精度相對(duì)提高了3.0%和5.0%。綜上所述，GS可能是提高凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌抗性遺傳增益的一種替代途徑。

背景

南美白對(duì)蝦是世界上養(yǎng)殖最廣泛的海洋物種之一。但是，蝦業(yè)受到病毒和細(xì)菌引起的疾病的阻礙。尤其是近年來，急性肝胰腺壞死?。ˋHPND），也稱為早期死亡綜合癥（EMS），嚴(yán)重威脅了全球?qū)ξr養(yǎng)殖的可持續(xù)性和盈利能力。自2010年首次爆發(fā)AHPND以來，該病已在世界許多地區(qū)發(fā)生。據(jù)估計(jì)，到2013年，AHPND造成的年度經(jīng)濟(jì)損失超過10億美元。為了減少AHPND對(duì)蝦養(yǎng)殖造成的生產(chǎn)損失，已采取了包括改善蝦養(yǎng)殖條件和加強(qiáng)養(yǎng)殖場管理在內(nèi)的一些策略。此外，育種者更加關(guān)注選擇性育種，這是減少水生動(dòng)物疾病暴發(fā)的可持續(xù)方法。

選擇性育種已被廣泛用于水生動(dòng)物各種疾病性狀的遺傳改良中（Gjedrem和Robinson，2014； Gjedrem等，2012）。然而，經(jīng)典的選育方式的可靠性有限，因?yàn)樗驗(yàn)樽疃嘀荒芾每傔z傳變異的50％（Nirea等，2012）。此外，此外，經(jīng)過抗病性測試的動(dòng)物不能用作繁殖種群。相比之下，基因組選擇（GS）對(duì)于抗病性可能特別有價(jià)值。GS可以使用全基因組標(biāo)記來計(jì)算候選育種動(dòng)物的基因組估計(jì)育種價(jià)值（GEBV）（Meuwissen等，2001）。與傳統(tǒng)的選擇方法相比，GS可以提高抗病性狀的選擇準(zhǔn)確性。另外，預(yù)計(jì)GS會(huì)降低近交率，因?yàn)樗梢栽诩蚁抵袑?shí)現(xiàn)更好的區(qū)分，并降低同胞的共選率。最近對(duì)幾種水生動(dòng)物物種的研究表明，GS在加速抗病性狀遺傳改良過程中具有巨大潛力。然而，由于基因組大小的差異和不同性狀的遺傳結(jié)構(gòu)，不同物種間不同性狀的GS表現(xiàn)差異很大。以前的研究表明，GS是促進(jìn)南美白對(duì)蝦生長性狀遺傳改良的有力工具。然而，迄今為止，尚無報(bào)道調(diào)查GS對(duì)蝦抗病性的可行性。因此，就其對(duì)南美白對(duì)蝦溶血弧菌的抗性而言，評(píng)估GS在南美白對(duì)蝦南美白對(duì)蝦中的性能是有價(jià)值的。本研究對(duì)南美白對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性遺傳力進(jìn)行了估計(jì)，并對(duì)GS用于提高對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌抗性的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨在為GS在對(duì)蝦育種中的應(yīng)用提供支持。

2.材料和方法

2.1. 弧菌侵染測試

從中國海南省廣泰海洋養(yǎng)殖公司獲得的200只個(gè)體被用于挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。簡而言之，所有樣本都來自2015年7月建立的13個(gè)全同胞家系(13個(gè)母本和13個(gè)父本的后代)。每個(gè)全同胞家系分別在5m2的水箱中培育幼苗。（家系飼養(yǎng)）在長到3厘米后，每個(gè)家庭中的50只個(gè)體被用熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。貼上標(biāo)簽后，這些蝦被集體飼養(yǎng)在一個(gè)10平方米的池塘里。（混養(yǎng)）在收獲時(shí)，隨機(jī)抽取了200只個(gè)體進(jìn)行挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。每只對(duì)蝦注射副溶血弧菌10ul(本實(shí)驗(yàn)室分離株)，濃度為2.52×107CFU/mL。將注入的對(duì)蝦均勻分配到10個(gè)水箱中，加入25L過濾海水，水溫保持在24±1°C。挑戰(zhàn)試驗(yàn)持續(xù)194h，每隔4h記錄死亡人數(shù)，記錄個(gè)體存活時(shí)間。所有存活的蝦在侵染194小時(shí)被收集。

2.2. 侵染個(gè)體的表型和基因分型

對(duì)副溶血性弧菌的抵抗力為存活時(shí)間，定義為死亡的小時(shí)數(shù)，取值范圍為16~194h；二元存活，如果對(duì)蝦在攻擊試驗(yàn)中死亡，則得分為0，如果蝦存活到挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)束，則得分為1。
基因分型方法與前面描述的相同(Wang等人，2007a)。從對(duì)蝦肌肉中提取各樣品的基因組DNA。所有樣本個(gè)體都使用2bRAD技術(shù)進(jìn)行了基因分型(Wang等人，2012年)。經(jīng)過質(zhì)量控制，剔除樣本間漏檢率大于5%、等位基因頻率小于0.05的SNP，共獲得23049個(gè)SNP標(biāo)記。此外，Beagle 3.3.2用于推測缺失的基因型(Browning and Browning，2007)。

2.3. 用于仿真分析的數(shù)據(jù)集

為了評(píng)估GS對(duì)多個(gè)體、多標(biāo)記副溶血弧菌抗性的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了模擬分析。QMSim軟件被用于模擬具有實(shí)時(shí)過程的南美白對(duì)蝦種群（Sargolzaei和Schenkel，2009）。首先，設(shè)計(jì)相等數(shù)量的雄性和雌性、離散世代、隨機(jī)交配、不遷移和不選擇，以2000個(gè)個(gè)體的恒定有效種群規(guī)模生成包括1000代的連續(xù)種群。然后，為了產(chǎn)生兩個(gè)遺傳分化的群體，從上一代(1000代)歷史群體中隨機(jī)抽取了300只動(dòng)物(100只雄性和200只雌性)作為兩個(gè)不同種群的創(chuàng)建者并且每個(gè)個(gè)體隨機(jī)交配了30代。對(duì)于這兩個(gè)種群，每個(gè)雌性都設(shè)定了50個(gè)后代(每個(gè)雄性100個(gè)后代)，結(jié)果是每個(gè)世代有200個(gè)家系，有1萬只繁殖動(dòng)物。在1030代，分別從兩個(gè)不同群體中隨機(jī)抽取1000只動(dòng)物進(jìn)行基因組選擇實(shí)驗(yàn)。由于南美白對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性尚未開展過選育工作，因此在本步驟中沒有進(jìn)行選育。對(duì)于連續(xù)群體和近期群體，僅考慮加性效應(yīng)的遺傳力設(shè)置為0.2。模擬基因組由44條長度為97 cM的染色體組成，總長度為4268 cM，與南美白對(duì)蝦的真實(shí)基因組大小相似(于等，2015)。對(duì)于每條染色體，模擬了1500個(gè)雙等位基因標(biāo)記和100個(gè)QTL。每個(gè)基因座的等位基因數(shù)量從2到4不等，QTL等位基因效應(yīng)從形狀參數(shù)為0.4的伽馬分布中提取。標(biāo)記突變率為2.5×10?5，QTL突變率為2.5×10-5。

2.4 統(tǒng)計(jì)模型

基于譜系的最佳線性無偏預(yù)測（PBLUP）：用BLUP(Henderson，1984)估計(jì)了傳統(tǒng)的基于系譜的方差分量和估計(jì)育種值(EBV)。等式（1）和（2）分別用于真實(shí)數(shù)據(jù)集和模擬數(shù)據(jù)集：

基因組最佳線性無偏預(yù)測(GBLUP)：基因組最佳線性無偏預(yù)測(GBLUP)模型被用來預(yù)測基因組估計(jì)育種值(GEBV)。除了使用基因組關(guān)系矩陣(G矩陣)之外，該模型與PBLUP模型類似，基因組關(guān)系矩陣的構(gòu)造如下

其中W是第t個(gè)SNP的AA，Aa，aa基因型元素為2-2pt，1-2pt和-2pt的加性標(biāo)記協(xié)變量的矩陣。pt是第t個(gè)SNP的等位基因A的頻率qt = 1-pt ；m是SNPs的數(shù)量。
A矩陣是利用R包‘pedigreemm’中的兩代系譜構(gòu)建的。上述模型是由R包‘BGLR’使用貝葉斯方法實(shí)現(xiàn)的。Gibbs抽樣總共使用了100,000次迭代，前10,000次迭代作為burn-in，被丟棄。

2.5. 遺傳力

根據(jù)弧菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)記錄的表型數(shù)據(jù)，計(jì)算了存活時(shí)間和二元存活的遺傳力，如下所示：

其中σa2和σe2為加性遺傳方差和殘差方差。方差分量用BGLR程序包分別使用A矩陣和G矩陣進(jìn)行估計(jì)。對(duì)于二元生存，殘差方差設(shè)置為1

2.6.交叉驗(yàn)證和預(yù)測準(zhǔn)確性

為了比較PBLUP和GBLUP的預(yù)測精度，采用了五次交叉驗(yàn)證方案。簡而言之，數(shù)據(jù)集被隨機(jī)分成五個(gè)子集。將四個(gè)子集(80%)組合成用于估計(jì)遺傳效應(yīng)的訓(xùn)練集，剩余的子集是驗(yàn)證集，其中表型記錄被掩蔽。為了減少抽樣的隨機(jī)影響，交叉驗(yàn)證分析重復(fù)了20次。因此，共進(jìn)行了100次交叉驗(yàn)證分析。
在模擬分析中，使用真實(shí)育種值(TBV)和EBV(GEBV)之間的相關(guān)性來衡量預(yù)測精度。在真實(shí)數(shù)據(jù)集中，TBV是未知的，因此預(yù)測精度調(diào)整如下。

其中r(EBV，y)是給定模型(使用來自訓(xùn)練集的信息對(duì)驗(yàn)證集進(jìn)行預(yù)測)的EBV(GEBV)和y之間的相關(guān)性，y是觀察到的表型；

h是利用系譜信息計(jì)算的遺傳力的平方根。

3 結(jié)果和討論

3.1 弧菌抗性實(shí)驗(yàn)的表型統(tǒng)計(jì)

對(duì)蝦的平均體重為5.56±2.16g，平均體長為77.0±10.0 mm。不同家系的對(duì)蝦在不同時(shí)間存活的情況如圖1所示，死亡發(fā)生在感染后16h，一直持續(xù)到120h，感染實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(194h)共死亡103只，占種群總數(shù)的51.5%。不同家系的對(duì)蝦死亡率在0%(Fam13)~83%(Fam4)之間，表明利用選育技術(shù)提高凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性是可行的。

3.2 弧菌抗性遺傳力的研究

狹義遺傳力是數(shù)量遺傳學(xué)的核心參數(shù)，代表加性遺傳效應(yīng)引起的總表型變異的比例。在這項(xiàng)研究中，通過使用來自13個(gè)全同胞家庭的挑戰(zhàn)個(gè)體的表型，估計(jì)了生存時(shí)間和二元生存的方差分量。在這項(xiàng)研究中，通過使用來自13個(gè)全同胞家庭的挑戰(zhàn)個(gè)體的表型，估計(jì)了生存時(shí)間和二元生存的方差組分。對(duì)于生存時(shí)間，用A矩陣和G矩陣估計(jì)的狹義遺傳力分別為0.24±0.09和0.26±0.10。對(duì)于二元生存，使用A矩陣和G矩陣估計(jì)的狹義遺傳力分別為0.15±0.07和0.16±0.09。這一結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性具有中等程度的遺傳變異，這與以往報(bào)道的凡納濱對(duì)蝦抗病性狀的遺傳力為中低水平相似，其遺傳力在h2=0.03的對(duì)WSSV抗性于0.3的對(duì)TSV抗性之間。雖然抗病性狀表現(xiàn)出低到中等的遺傳力，但通過傳統(tǒng)的選擇育種已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了遺傳改良。對(duì)蝦對(duì)TSV感染存活的遺傳進(jìn)展在12.4%~18.4%之間。南美白對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后，經(jīng)過三代的選擇，估計(jì)存活的選擇反應(yīng)達(dá)到22.7%。在本研究中，對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抵抗力估計(jì)為近似中等遺傳力。這一結(jié)果表明，實(shí)施南美白對(duì)蝦抗副溶血弧菌遺傳改良的選育方案是可行的。

3.3. 基因組預(yù)測的準(zhǔn)確性

基于真實(shí)數(shù)據(jù)集，表1顯示了基于PBLUP和GBLUP方法的生存時(shí)間和二元生存的預(yù)測精度?？傊?，GBLUP可以比PBLUP產(chǎn)生更準(zhǔn)確的預(yù)測，并且預(yù)測準(zhǔn)確度的相對(duì)增加對(duì)于生存時(shí)間是6.8％，對(duì)于二元生存率是3.5％。對(duì)于模擬數(shù)據(jù)集獲得了相似的結(jié)果。當(dāng)將PBLUP與GBLUP進(jìn)行比較時(shí)，生存時(shí)間和二進(jìn)制生存率的預(yù)測準(zhǔn)確性分別提高了3.0％和5.0％。當(dāng)前的研究表明，GS可以是加速該性狀遺傳進(jìn)展的有效途徑。

在當(dāng)前的研究中，有趣的是注意到在真實(shí)數(shù)據(jù)集和模擬數(shù)據(jù)集之間，兩種模型的預(yù)測精度都有細(xì)微的差異。實(shí)際數(shù)據(jù)集和模擬數(shù)據(jù)集之間的預(yù)測準(zhǔn)確性差異可能是由幾個(gè)因素引起的，包括群體規(guī)模，標(biāo)記物密度和獨(dú)立的染色體片段等。總的來說，這一結(jié)果表明關(guān)于凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血性弧菌的抗性的遺傳基礎(chǔ)的假設(shè)，包括QTL的數(shù)目和QTL突變率等，可能很符合實(shí)際。此外，值得注意的是，在真實(shí)數(shù)據(jù)集中觀察到的兩種模型的預(yù)測精度的標(biāo)準(zhǔn)偏差比在模擬數(shù)據(jù)集中觀察到的高。真實(shí)數(shù)據(jù)集中有限的種群規(guī)模和復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致預(yù)測精度差異較大的主要因素。以往對(duì)家畜、植物和水生動(dòng)物的研究表明，訓(xùn)練種群規(guī)模的減小會(huì)對(duì)群體決策的預(yù)測能力產(chǎn)生負(fù)面影響，并顯著降低預(yù)測質(zhì)量。此外，包括訓(xùn)練群體的組成結(jié)構(gòu)以及訓(xùn)練種群與驗(yàn)證種群之間的關(guān)系也是影響GEBV預(yù)測的關(guān)鍵因素，并可能導(dǎo)致基因組預(yù)測的準(zhǔn)確性出現(xiàn)偏差。

雖然在模擬數(shù)據(jù)集中已經(jīng)使用了大量的群體來評(píng)估GS的表現(xiàn)，但在比較PBLUP和GBLUP時(shí)，發(fā)現(xiàn)凡納美乳桿菌對(duì)副溶血弧菌抗性的準(zhǔn)確性提高得比以前的報(bào)道要低。例如，A發(fā)現(xiàn)，與使用57K SNP陣列對(duì)1934只動(dòng)物進(jìn)行基因分型的PBLUP相比，使用GBLUP對(duì)虹鱒魚對(duì)鮭魚的抗性進(jìn)行預(yù)測的能力相對(duì)提高了28%。同樣，在用50K SNP序列對(duì)2392個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因分型時(shí)，GBLUP模型和PBLUP模型相比，大西洋鮭魚對(duì)三文魚的抗性預(yù)測準(zhǔn)確率相對(duì)提高(21%和27%)。結(jié)果表明，GBLUP模型與PBLUP模型相比，對(duì)大西洋鮭魚對(duì)三文魚的抗性預(yù)測準(zhǔn)確率相對(duì)提高(21%和27%)。這些研究結(jié)果的差異可能與這些物種間連鎖不平衡(LD)水平的差異有關(guān)。在本研究中，由于育種歷史短和種群來源廣泛，模擬種群可能具有極低的LD水平。因此，更多的標(biāo)記將有利于增強(qiáng)GS的能力。此外，抗性性狀被模擬為一個(gè)受大量效應(yīng)較小的QTL控制的復(fù)雜性狀，因此目前的群體規(guī)模可能仍不足以準(zhǔn)確估計(jì)這些效應(yīng)。因此，今后利用更多的標(biāo)記和更多的表型來研究GS對(duì)對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性是非常有價(jià)值的。

結(jié)論

本研究檢測到南美白對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性具有接近中等的遺傳力，表明通過選擇育種進(jìn)行遺傳改良是可行的。GBLUP分析比PBLUP具有更高的預(yù)測精度，這表明GS可能是提高南美白對(duì)蝦抗副溶血弧菌遺傳增益的一種新途徑。此外，還應(yīng)利用群體規(guī)模大、標(biāo)記密度高的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)GS在提高對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌抗性方面的有效性。