寫在前面：western?blot，這個(gè)不做個(gè)十次八次，基本出不來好看條帶的實(shí)驗(yàn)，相信讓很多小伙伴都感到頭禿。不過只要持之以恒，善于總結(jié)，問題不大，隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增多，會(huì)持續(xù)更新內(nèi)容，個(gè)人見解存在一定局限性，歡迎一起交流哈~
做膠?
Q.?注意事項(xiàng)
配緩沖液過程中，過硫酸銨最后加，防止出現(xiàn)過多氣泡。
溫度：溫度越高凝固越快，膠通常在0.5-1h內(nèi)凝固最好。充分凝固后可保鮮膜包裹4℃過夜，第二天使用。
Q.?如何判斷樣品總蛋白的提取是否成功？
跑膠前：蛋白濃度檢測，濃度低可能是提取不成功。
轉(zhuǎn)膜后：麗春紅染色，正常的話可以看到很多蛋白條帶。
顯色后：內(nèi)參及目的蛋白的檢測。
上樣
Q.?上樣時(shí)有的樣品沉淀，有的清亮？
1.考慮沒有完全變性，適當(dāng)提高SDS濃度，同時(shí)延長煮沸時(shí)間。
2.考慮蛋白濃度過高，加入緩沖液稀釋。
電泳
Q. 影響電泳結(jié)果的因素
1.?電壓：低電壓下篩選效應(yīng)充分，條帶漂亮。
2. 膠的均勻度：膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。
Q.?條帶形狀
︶笑臉型：凝結(jié)冷卻不均勻，中間冷卻不好。
︵皺眉狀：可能凝膠和玻璃板底部有氣泡。
拖尾：樣品溶解不好
縱向條紋：樣品中有不溶性顆粒
條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜
條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過多溢出
Q.?大分子量蛋白轉(zhuǎn)移效率低？
轉(zhuǎn)移緩沖液加SDS（終濃度0.1%）；提高轉(zhuǎn)移電壓/電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間
Q.?小分子量蛋白轉(zhuǎn)移需注意？
使用0.22um 或0.1um 的NC膜；減少轉(zhuǎn)移時(shí)間，30min足夠。
轉(zhuǎn)膜
我們用的是濕轉(zhuǎn)法，效率比較高，如果目的蛋白很小，可以考慮半干轉(zhuǎn)。
Q.?過轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)膜不充分？
對(duì)于大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不用考慮過轉(zhuǎn)情況，看條帶對(duì)應(yīng)的marker是否轉(zhuǎn)上，即可確定自己的條帶是否轉(zhuǎn)上。如果沒有，適當(dāng)增加電壓/電流，延長時(shí)間，還有避免膠和膜中間有氣泡。
小分子量（<15kd）尤蛋白容易出現(xiàn)過轉(zhuǎn)，同樣麗春紅染膜或觀察marker即可確認(rèn)有沒有過轉(zhuǎn)。
Q.?PVDF的預(yù)處理？
PVDF膜先置于甲醇中處理10 s，然后浸于電轉(zhuǎn)緩沖液中10 min，再夾三明治。NC膜則不需要預(yù)處理。
封閉
我們用的是5%脫脂奶粉，10%TBS緩沖液配制。
Q.?封閉時(shí)間
正常情況，室溫封閉1h即可。如果曝光背景過高，可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間至2-5h，也可以4℃過夜，封閉時(shí)間過長并不會(huì)導(dǎo)致檢測信號(hào)減弱。
如果延長了封閉時(shí)間，背景還是高?？紤]抗體濃度過高，可稀釋使用；目的蛋白豐度太低，信號(hào)弱。
Q. 封閉液有雜質(zhì)顆粒?
（靜置牛奶使大顆粒沉淀，僅用上層）
牛奶里面會(huì)有一些不懸浮的大顆粒，對(duì)封閉無益?？梢栽谵D(zhuǎn)膜開始之后配好牛奶，在充分?jǐn)嚢韬玫那疤嵯拢o置于4℃。使用時(shí)不要擔(dān)心牛奶不均而特意混勻，只吸上層部分完全ok。
孵抗體
Q.?如何提高磷酸化抗體的檢測質(zhì)量？
提高蛋白上樣量；適當(dāng)增加封閉時(shí)間，延長一抗孵育時(shí)間；封閉的選擇：5%脫脂奶粉？ 5%BSA？；磷酸酶抑制劑；樣本低溫操作，最好是新鮮樣品，反復(fù)凍融易降解。
顯影
Q.?目的條帶很弱？
加大上樣量，調(diào)整抗體比例，轉(zhuǎn)膜效率。
Q.?背景太深？
降低抗體比例；封閉液中加去垢劑：吐溫20；降低上樣量；用其他蛋白做封閉液：5%BSA，serum；
Q.?條帶有時(shí)清晰，有時(shí)彌散？
樣品可能存在降解；轉(zhuǎn)膜不及時(shí)造成擴(kuò)散。
