背景介紹
人口老齡化是世界各國亟待解決的問題。機(jī)體衰老與下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞衰竭密切相關(guān)。下丘腦是人體的神經(jīng)-內(nèi)分泌高級調(diào)節(jié)中樞，研究衰老的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制，篩選出維持下丘腦干細(xì)胞活力的小分子化合物，有助于深入了解與衰老相關(guān)的病理過程，提供藥理靶向?qū)W研究的理論依據(jù)，為延緩衰老、預(yù)防衰老病變、提高健康壽命帶來新的希望。
中南大學(xué)湘雅醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝團(tuán)隊(duì)從衰老的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制研究切入，發(fā)現(xiàn)一種在下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞中高度表達(dá)、并隨年齡增長逐漸減少的長鏈非編碼RNA——Hnscr?。Hnscr的耗竭可引起下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞衰老，并誘發(fā)小鼠出現(xiàn)衰老表型。他們運(yùn)用蛋白質(zhì)互作實(shí)驗(yàn)確證了與Hnscr具有高度親和力的一種蛋白YB-1（Y-box Protein 1），并通過分子模擬和虛擬篩選找到了與YB-1相互作用的天然化合物TF2A，為設(shè)計(jì)研發(fā)改善衰老相關(guān)病變的藥物提供了理論依據(jù)。
下丘腦在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，它通過與外周組織進(jìn)行交互和對環(huán)境和營養(yǎng)信息的變化作出反饋，調(diào)節(jié)生理的各方面功能。文獻(xiàn)記載下丘腦在監(jiān)督衰老過程中起著關(guān)鍵作用，而下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞（Hypothalamus Neural Stem Cells, htNSCs）參與了這一過程。研究人員首先通過前期小鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一種長鏈非編碼RNA——Hnscr與小鼠的衰老表型有關(guān)，然后通過機(jī)制研究證實(shí)Hnscr與YB-1 蛋白結(jié)合時會阻止后者降解、并引起衰老標(biāo)記基因?p16INK4A?的轉(zhuǎn)錄衰減。這些發(fā)現(xiàn)表明YB-1可能是調(diào)控htNSC衰老的一個潛在的分子靶點(diǎn)。
基于以上實(shí)驗(yàn)事實(shí)，研究人員在殷賦云平臺（https://cloud.yinfotek.com/）上對YB-1蛋白與Hnscr結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，采用本平臺的虛擬篩選方案，從化合物庫TargetMol 中找到一個天然小分子化合物TF2A（茶黃素3-沒食子鹽酸，Theaflavin 3-Gallate）。該物質(zhì)源自紅茶提取物，可以模擬Hnscr的活性，增強(qiáng) YB-1 蛋白的穩(wěn)定性，保護(hù)它不被泛素化降解，從而減少 htNSC 細(xì)胞的衰老，改善年齡相關(guān)的疾病。這些發(fā)現(xiàn)揭示了衰老過程中的一種介導(dǎo)因子，為藥理靶向?qū)W的研究提供了理論依據(jù)。
下文針對本研究中的基于分子對接的虛擬篩選方法展開介紹。
以人類YB-1結(jié)構(gòu)（PDB代碼：1H95）為模板，利用Modeller軟件對小鼠YB-1結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源建模。
選擇能量最低的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化。
為了確定優(yōu)化的構(gòu)象，對小鼠YB-1預(yù)測結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)（loop）進(jìn)行優(yōu)化（refinement）。
使用在線工具POCASA 1.1預(yù)測YB-1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
通過AutoDock Vina和Dock 6分子對接方案先后對化合物庫TargetMol中的天然小分子化合物進(jìn)行了虛擬篩選。
圖1. (A) 小鼠 YB-1 的優(yōu)化同源建模結(jié)構(gòu)。(B) TF2A 的分子結(jié)構(gòu)。(C) AutoDock Vina 生成的結(jié)合能最低的優(yōu)化結(jié)合模式和 TF2A 與小鼠 YB-1 相互作用的關(guān)鍵殘基。
研究者首先對小鼠YB-1蛋白進(jìn)行了同源建模，發(fā)現(xiàn)該蛋白中有一個口袋狀結(jié)構(gòu)。如圖1A所示，綠色條帶（green ribbon）表示主要的桶狀結(jié)構(gòu)，由 6 個反向疊層的 β-sheet組成。桶狀結(jié)構(gòu)上部為動態(tài)環(huán)區(qū)（dynamic loop，小麥色），預(yù)測結(jié)果顯示它們之間存在由 12 個疏水氨基酸組成的小分子結(jié)合口袋（如粉紅色小球所示）。分析預(yù)測結(jié)果提示，YB-1的N端有42-53個氨基酸（aa. 42-53）對這個口袋狀結(jié)構(gòu)的形成非常重要。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也可以看到Y(jié)B-1中氨基酸42-53的缺失導(dǎo)致Hnscr與YB-1之間的相互作用中斷（圖2C和2D），這表明口袋狀結(jié)構(gòu)對于YB-1與Hnscr的結(jié)合是至關(guān)重要的。
圖2. (C) YB-1全長和截斷碎片示意圖。(D) Hnscr下拉YB-1截短片段的western blot analysis（蛋白質(zhì)印跡分析）。
為了篩選出對YB-1具有穩(wěn)定作用的天然小分子化合物，研究者從天然小分子化合物庫TargetMol中挑選出6000多種靶分子化合物進(jìn)行了分子對接和虛擬篩選。依據(jù)成藥性（drugability）標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)合親和力信息，研究人員選擇了排名最靠前的5個小分子作為苗頭化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試（圖3）。
圖3. 從TargetMol選出的排名靠前的5個小分子化合物。
由圖3可見，茶黃素3-沒食子酸酯（TF2A）是最優(yōu)選擇，因?yàn)榉肿訉咏Y(jié)果表明它與YB1的親和力最大（對接打分Grid Score = -83.12 kcal/mol），可以進(jìn)入YB-1的口袋狀結(jié)構(gòu)（圖1C)。實(shí)驗(yàn)測得4個受試小分子化合物中，只有TF2A增強(qiáng)了3月齡WT小鼠htNSCs中YB-1的表達(dá)水平。
圖4. （A-D） 四種小分子化合物作用于HTNSCs的YB-1蛋白水平，其中，D為TF2A。
TF2A的作用機(jī)制還可以從分子對接結(jié)合模式中獲得解釋。限于篇幅，本文不詳細(xì)討論分析結(jié)果。想了解更多有關(guān)分子對接分析的內(nèi)容，可閱讀本專輯（見文章開頭或下方往期好文）的前幾期文章。
在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)YB-1可能是調(diào)控htNSC衰老的潛在靶點(diǎn)，于是通過殷賦云平臺基于分子對接的虛擬篩選方案確定了可與之結(jié)合的天然小分子化合物TF2A。該分子有助于提高蛋白的穩(wěn)定性，同時減緩htNSCs衰老和減輕小鼠衰老相關(guān)的生理衰退程度。該天然產(chǎn)物可作為先導(dǎo)化合物，用于設(shè)計(jì)開發(fā)減緩htNSC細(xì)胞衰老并改善某些衰老相關(guān)并發(fā)癥的新藥，為延緩衰老、預(yù)防衰老病變、提高健康壽命帶來新的希望。該成果已經(jīng)發(fā)表在代謝研究領(lǐng)域頂級期刊《Cell Metabolism》上（IF= 22.415）。
Xiao,?Yu-Zhong?et?al.?"Reducing?Hypothalamic?Stem?Cell?Senescence?Protects?against?Aging-Associated?Physiological?Decline."?Cell?metabolism?vol.?31,3?(2020):?534-548.e5.?doi:10.1016/j.cmet.2020.01.002
