一、格式介紹
（一）gtf 文件。GTF 為General Transfer Format縮寫，跟 GFF2格式類似。相信大家做轉(zhuǎn)錄組分析時候經(jīng)常會看到Cufflinks或者Stringtie軟件對轉(zhuǎn)錄組進行定量與組裝會時產(chǎn)生一個gtf文件，里面包含的信息如下：
每列信息的含義如下：
seqname?- 序列的ID，可以是染色體的ID也可以是Scaffold或者Contig的ID。
source?- 產(chǎn)生此文件的軟件，如Stringtie產(chǎn)生的則為Stringtie，CUfflinks產(chǎn)生的則為Cufflinks，不知道的使用點 “.” 表示。
feature?- 后面start和end之間區(qū)域代表的特征，如果此區(qū)域是基因，則此處為gene，如果是外顯子，則為exon，如果是轉(zhuǎn)錄本，則為transcript，如果是非編碼RNA則為lncRNA，如果是重復(fù)序列，則為TE，等等，主要表明這一塊區(qū)域的特征。
start?-上述feature的在序列上的起始位置。
end?- 上述feature的在序列上的終止位置。
score?- 一個浮點數(shù)值，也可以為點 “.” 。有值的時候代表上述feature的可靠
性。因為無論是gene還是mRNA，都是基于預(yù)測差生的，因而必然會有一個值來衡量預(yù)測準(zhǔn)確性。
strand?- + (forward)或者 - (reverse)，代表上述feature是位于正鏈還是負鏈上。
frame?- 內(nèi)含子相位，只能為'0', '1' or '2'，或者為點 “.”。 '0' 代表feature起始堿基為三聯(lián)體密碼子的第一個堿基, '1' 代表三聯(lián)體密碼子的第2個堿基, 2代表第3個堿基。
attribute?-備注列。主要備注該feature的一些信息，常見的是gene或者transcript等的ID信息以及FPKM值等，多個備注信息之間通常用分號分隔。
（二）gff 格式。為general feature format縮寫，目前采用的是version 3，即我們常說的gff3文件。該文件常用來對基因組進行注釋，表示基因，外顯子，CDS，UTR等在基因組上的位置。眾多基因預(yù)測軟件如Glean，EVM，AUGUSTUS等會產(chǎn)生此格式文件。
與gtf文件不同之處只是在第9列。此列格式為“標(biāo)簽＝值”（tag=value），標(biāo)簽與值之間用“=”，不同的標(biāo)簽之間用“；”隔開，一個標(biāo)簽可以有多個值，不同值用“,”分割。
二、gtf與gff轉(zhuǎn)換以及對GFF文件進行過濾。
常采用的軟件是gffread，為Cufflinks自帶的一個程序，他不僅可以實現(xiàn)GTF與GFF的互相轉(zhuǎn)換，而且還可以對GFF文件進行過濾處理。以下是gffread的幫助信息：
Usage:
gffread <input_gff> [-g <genomic_seqs_fasta> | <dir>][-s <seq_info.fsize>]?
?[-o <outfile.gff>] [-t <tname>] [-r [[<strand>]<chr>:]<start>..<end> [-R]]
?[-CTVNJMKQAFGUBHZWTOLE] [-w <exons.fa>] [-x <cds.fa>] [-y <tr_cds.fa>]
?[-i <maxintron>]?
<input_gffmatch>為一個GFF/GTF文件，必填的一個文件
常用參數(shù)介紹：
?-g ?序列文件，即GFF/GTF文件第一列ID對應(yīng)的序列文件。
?-i ?丟棄掉內(nèi)含子大于的轉(zhuǎn)錄本（mRNA/transcript）
?-r ?起始和終止位置，填寫示例100.10000即為輸出與100到10000有重疊的所有轉(zhuǎn)錄組，也可以限制序列ID及鏈，填寫示例：+Chr1:100..10000。
?-R ?丟棄掉此范圍的轉(zhuǎn)錄本，與-r相反。
?-U ?丟棄掉 single-exon的轉(zhuǎn)錄本
?-C ?丟低調(diào)無CDS的轉(zhuǎn)錄本。
?-V ?丟棄掉含有移碼突變的轉(zhuǎn)錄本。
?-H ?如果使用了-V，則重新檢查并調(diào)整內(nèi)含子相位，避免由于翻譯起始位點選擇的位置不對導(dǎo)致移碼突變的產(chǎn)生。
?-B 如果使用了-V， 對于單外顯子基因，則重新檢查相反的鏈，是否存在移碼突變。
?-N ?丟棄掉多外顯子基因剪接位點不是常見的 GT-AG, GC-AG or AT-AC序列。
?-J ?丟棄掉沒有起始密碼子或者終止密碼子的轉(zhuǎn)錄本，僅保留有完整編碼框的轉(zhuǎn)錄本。
?--no-pseudo:過濾掉含有 'pseudo' 的注釋信息
?-M/--merge : 合并完全相同的或者存在包含關(guān)系的轉(zhuǎn)錄本。
-d:使用 -M ，將合并信息輸出到文件中
?--cluster-only: 類似于 --merge 但是不合并轉(zhuǎn)錄本
-K ?對于-M 選項：also collapse shorter, fully contained transcripts
? ? ? with fewer introns than the container
-Q?對于-M 選項：移除包含關(guān)系的轉(zhuǎn)錄本的限制條件：多外顯子轉(zhuǎn)錄本將會合并，如果他們內(nèi)含子位置完全一樣，單外顯子轉(zhuǎn)錄本只需要有80%一樣即可合并。
?--force-exons: ?使GFF features的最小層級為exon
?-E 對于重復(fù)的 ID或者?GFF/GTF 其他潛在的格式問題給出警告信息。
-Z ?將內(nèi)含子小于4 bp的鄰近的兩個外顯子合并為一個。
?-w ?輸出每個轉(zhuǎn)錄本的外顯子序列
?-x ?輸出CDS序列
?-W ?對于 -w 和 -x 選項，輸出外顯子位置坐標(biāo)到FASTA序列的ID中
?-y ?輸出蛋白質(zhì)序列
?-L ?將Ensembl GTF 轉(zhuǎn)換為 GFF3 conversion (implies -F; should be used with -m)
?-o ? 輸出"filtered" 后的GFF文件 。
-T ?-o 參數(shù)將輸出 GTF格式。
示例命令：
1.GFF轉(zhuǎn)換GTF
gffread input.gff3 -T -o out.gtf‘
2.GTF轉(zhuǎn)換GFF3
gffread input.gtf -o out.gff3
3.根據(jù)GFF或者GTF提取蛋白質(zhì)，CDS和外顯子序列
gffread gene.gff3 -g genome.fa -x cds.fa -y pep.fa -w cdna.fa
三、GFF文件比較
主要采用gffcompare（https://github.com/gpertea/gffcompare），其主要具有三個功能：1）評估Cufflinks/Stringtie等轉(zhuǎn)錄本組裝軟件的準(zhǔn)確性；2）合并多個GFF/GTF中重疊的部分（多個樣本組裝結(jié)果的合并）3）可以對一個或多個GTF/GFF文件的注釋相對于參考的GTF/GFF文件進行分類（with "class codes" assigned to transcripts as per their relationship with the matching/overlapping reference transcript），如Pacbio預(yù)測的GTF與參考GFF比較，修正和評估參考的注釋結(jié)果。
Usage:
gffcompare [-r <reference_mrna.gtf> [-R]] [-G] [-T] [-V] [-s <seq_path>]
? ? [-o <outprefix>] [-p <cprefix>]?
? ? {-i <input_gtf_list> | <input1.gtf> [<input2.gtf> .. <inputN.gtf>]}
常用參數(shù)介紹：
-i ?多個GTF 文件時，使用此選項較方便，將多個GTF文件寫在一個文件中，通過此選項傳入即可。
-r 參考的 GTF/GFF文件
-R ?針對的是-r參數(shù)，僅考慮參考與任何輸入的注釋文件有重疊的 。
-Q 針對的是-r參數(shù)，僅考慮輸入的注釋文件與任何參考有重疊的 。 ? ?(警告，這將丟棄所有的新的注釋位點）
-M 丟棄（忽略）掉輸入的注釋文件和參考注釋文件中單外顯子轉(zhuǎn)錄本
-N 丟棄（忽略）掉參考注釋文件中單外顯子轉(zhuǎn)錄本
-s 基因組序列文件
-e 當(dāng)評估外顯子準(zhǔn)確性時，離參考末端外顯子最遠的距離（默認100）
-d 轉(zhuǎn)錄本聚類時起始位點相差的最大距離 (默認100)
-C ?在.combined.gtf文件中包含 "contained" 類型的轉(zhuǎn)錄本
-F 如果僅是3’端不同，則不丟棄輸入的GTF文件中被參考包含的冗余的轉(zhuǎn)錄本注釋信息。
-G 不丟棄輸入的GTF文件中被參考包含的冗余的轉(zhuǎn)錄本注釋信息，主要是鑒于可變剪接。
-T 對于每一個輸入文件不產(chǎn)生 .tmap 和 .refmap文件
-V 給出 GFF 解析時的警告信息
參考命令：
gffcompare ?-r refChr.gff3 ?-R -G -o combine input.gtf
輸出結(jié)果中有以下幾個文件：
combine.combined.gtf
combine.loci
combine.stats
combine.tracking
其中在combine.combined.gtf中有一個class_code 代表輸入的注釋文件與參考注釋文件相似性信息，具體如下：
#Transfrag class codes
PriorityCodeDescription
1=Complete match of intron chain
2cContained
3jPotentially novel isoform (fragment): at least one splice junction is shared with a reference transcript
4eSingle exon transfrag overlapping a reference exon and at least 10 bp of a reference intron, indicating a possible pre-mRNA fragment.
5iA transfrag falling entirely within a reference intron
6oGeneric exonic overlap with a reference transcript
7pPossible polymerase run-on fragment (within 2Kbases of a reference transcript)
8rRepeat. Currently determined by looking at the soft-masked reference sequence and applied to transcripts where at least 50% of the bases are lower case
9uUnknown, intergenic transcript
10xExonic overlap with reference on the opposite strand
11sAn intron of the transfrag overlaps a reference intron on the opposite strand (likely due to read mapping errors)
12.(.tracking file only, indicates multiple classifications)
由于輸出文件幾乎跟cuffcompare格式幾乎是一樣的，
更詳細輸出介紹參見http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffcompare/。
轉(zhuǎn)自：http://www.huoyunjn.com/wuliuxinwen/2/33709819.htm
