1.安裝getorganelle

conda create -n getorganelle python=3.6.8
#創(chuàng)建getoganelle的環(huán)境，可通過python3 -V查看當(dāng)前的python版本，使用系統(tǒng)中存在的python版本
conda install -n getorganelle -c bioconda getorganelle=1.7.7
#在miniconda3上安裝指定版本的getorganelle

2.安裝葉綠體基因組等數(shù)據(jù)庫

get_organelle_config.py --add embplant_pt
#安裝葉綠體基因組等數(shù)據(jù)庫（植物葉綠體基因組：embplant_pt，植物線粒體基因   組：embplant_mt，植物核核糖體DNA片段：embplant_nr）

小插曲：在安裝參考基因組時發(fā)現(xiàn)報錯：ERROR: Blast is not available!
當(dāng)時以為是blast沒有安裝，安裝了blast依然報錯，嘗試在打開getorganelle的情況下查看blast版本blastn -V，發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步顯示為blastn: error while loading shared libraries: libnsl.so.1: cannot open shared object file: No such file or directory
這說明是libnsl.so.1這個庫沒有存在于getorganelle這個軟件的環(huán)境的,進(jìn)入目錄/home/monkeyflower/miniconda3/envs/getorganelle/lib查找這個庫，發(fā)現(xiàn)里面有個libnsl.so.3的庫，直接改掉這個庫的名稱，發(fā)現(xiàn)可以運行了。

3.運行g(shù)etorganelle

先將需要拼接的序列文件傳輸?shù)?home/monkeyflower/bioworkplace目錄下(最好每次建一個單獨的文件夾以保存運行結(jié)果)

cd /home/monkeyflower/bioworkplace
conda activate getorganelle
#激活軟件

4.拼接代碼

get_organelle_from_reads.py -1 sampleA_1.fq.gz -2 sampleA_2.fq.gz -F embplant_pt -o organellefile -R 10 -t 2 -k 21,45,65,85,105,127 
#文件名不得有任何空格
-1和-2     正向和反向測序原始數(shù)據(jù)文件(如果是單向測序,-u)
-F         設(shè)定要組裝的基因組類型
-o         結(jié)果輸出保存的目錄(文件夾)名稱
-R         提取葉綠體基因 reads 的輪次(輪次越多,耗時越長)
-t         并行使用 CPU 的數(shù)量(多核可提速),默認(rèn)值是1
-k         調(diào)用SPAdes進(jìn)行 denovo組裝的k-mer,數(shù)值必須是奇數(shù),最大值是127
也可使用以下代碼可縮短運行時間
get_organelle_from_reads.py -1 sampleA.1.gz -2 CaryopterissampleA.2.gz -F embplant_pt -o organellefile --fast -k 21,65,105 -w 0.68 

5.拼接不成環(huán)解決辦法

圖一

發(fā)現(xiàn)可以先使用SPAdes對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝以獲得assembly_graph.fastg文件，對該文件再使用Getorganelle進(jìn)行拼接即可。具體流程如下：

5.1 SPAdes輔助拼接

5.1.1 SPAdes安裝

軟件安裝

conda create -n spades
conda activate spades
conda install -c bioconda spades=3.15.5
#創(chuàng)建環(huán)境并安裝指定版本的的spades

基本使用命令

spades.py -1 left.fq.gz -2 right.clean.fq.gz -o outputname -t 16

-1/2:雙端測序文件
-o:輸出文件目錄
-t:最大允許使用線程數(shù)，默認(rèn)為1

5.1.2 Getorganelle運行命令

get_organelle_from_assembly.py -g assembly_graph.fastg -F embplant_pt -o output-plastome -t 16

-g:SPAdes組裝得到的FASTG的assembly graph
-F:設(shè)定要組裝的基因組類型
-o:輸出文件目錄
-t:最大允許使用線程數(shù)
拼接結(jié)果基本都能成環(huán)，如下圖所示：

圖二

5.2 修改有關(guān)參數(shù)

5.2.1調(diào)整-w參數(shù)

如果服務(wù)器的內(nèi)存足夠，那么減少word(- w)參數(shù)。如果在命令中沒有特意指出-w參數(shù)，則程序會自動估計，在get_org.log.txt中會有記錄，如果估計的-w大小是105，可以嘗試減小為95。-w的取值范圍一般在65 ~ 105之間。

5.2.2增加--max-reads參數(shù)

--max-reads MAX_READS
                        Maximum number of reads to be used per file. Default:
                        1.5E7 (-F embplant_pt/embplant_nr/fungus_mt/fungus_nr); 7.5E7
                        (-F embplant_mt/other_pt/anonym); 3E8 (-F animal_mt)

陸生植物默認(rèn)參數(shù)為1.5E7，應(yīng)該提升一下讀數(shù)。

5.2.3添加參考物種

如果目標(biāo)基因組是動物有絲分裂組或者reads質(zhì)量較差，或者目標(biāo)覆蓋度極不均勻，則使用與之緊密相關(guān)的細(xì)胞器基因組作為seed( -s )。對于動物基因組組裝或沒有緊密相關(guān)seed的情況，使用前一次運行的輸出作為第二次運行的seed。

5.2.4調(diào)整-J/-M參數(shù)

主要是減小這兩個值，-J默認(rèn)值為3，減小該值，延伸步幅變小，reads 招募量增多；-M默認(rèn)值為2，減小 mesh 值，同樣增加延伸量。這兩個參數(shù)調(diào)整后會影響拼接速度。

5.3手動矯正

該種方法只適合拼接的序列長度大于該屬物種正?；蚪M大小，首先在NCBI上找同屬的物種的fasta文件然后與拼接得到的序列整序列比對，找出拼接序列多余的部分。在原來的拼接結(jié)果中刪除多余的這一部分，然后重新在這個geseq網(wǎng)站找出各部分的準(zhǔn)確位置，再截取拼接就得到正確的基因組了。

6.使用getorganelle繪制測序深度圖

evaluate_assembly_using_mapping.py -1 sampleA_1.fq.gz -2 sampleA_2.fq.gz -o coverage -f sequence.fasta -t 1 --continue --draw --plot-title title --plot-subtitle "subtitle"
#-1/-2:測序數(shù)據(jù)文件
#-o:輸出文件名稱
#-f:組裝成功的fasta序列
#-t:運行線程數(shù)
#--plot-title:圖片主標(biāo)題
#圖片副標(biāo)題