前言

在眾多癌癥類(lèi)型中，有一種在我國(guó)發(fā)病率不高，但是在國(guó)外卻很高的癌癥，那就是前列腺癌。因此，我們?cè)诟鞔笃诳暇芙?jīng)常看到有關(guān)前列腺癌的研究。這次Immugent給大家分享的文章，就是去年9月發(fā)表在Nature Communications(IF:14.919)上面一篇研究前列腺癌的文章。前列腺癌具有異質(zhì)性，那些對(duì)系統(tǒng)治療有反應(yīng)的患者，如果存在某些方法對(duì)這些患者進(jìn)行分層，那將使患者受益。這篇文章就是采用和單細(xì)胞RNA-seq和ATAC-seq測(cè)序，對(duì)恩雜魯胺(一種化療藥)的早期治療反應(yīng)和耐藥性模型進(jìn)行研究。

圖片

文章的亮點(diǎn)在于很巧妙的結(jié)合了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀(guān)組的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還用上了空間轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)。不僅解答了化療藥治療前后腫瘤細(xì)胞的變化，還對(duì)治療后復(fù)發(fā)的問(wèn)題給出了很多見(jiàn)解，因此這篇文章的思路很值得我們學(xué)習(xí)。

主要內(nèi)容

研究方法

1.RNA測(cè)序及預(yù)處理LNCaP和VCaP細(xì)胞系是從ATCC機(jī)構(gòu)獲得。VCaP細(xì)胞的RNA測(cè)序是用Illumina HiSeq3000進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)中對(duì)3個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行了測(cè)序，平均每個(gè)樣品獲得1.11億個(gè)雙端reads。在預(yù)處理過(guò)程中，基于Ensembl參考基因組GRCh38使用STAR對(duì)reads進(jìn)行了比對(duì)。使用featureCounts和Gencode注釋對(duì)read counts進(jìn)行了定量。

2.單細(xì)胞樣品制備和測(cè)序對(duì)于scRNA-seq，使用CellRanger將測(cè)序reads處理為FASTQ格式和單細(xì)胞特征counts。同樣地，使用CellRanger ATAC將scATAC-seq的測(cè)序reads處理為FASTQ格式，并計(jì)算峰-條形碼counts。LNCaP-ENZ168、VCaP和VCaP-ENZ48的Drop-seq(液滴測(cè)序)樣本經(jīng)過(guò)預(yù)處理、比對(duì)，并使用Drop-seq工具處理成細(xì)胞計(jì)數(shù)矩陣，預(yù)計(jì)每個(gè)樣本包含1000個(gè)細(xì)胞。該流程使用STAR和Picard工具，并使用了人類(lèi)參考基因組GRCh38和Gencode注釋。

3.甲醛輔助分離調(diào)控元件(FAIRE)測(cè)序和分析FAIRE分離的DNA片段用羅氏KAPA試劑盒進(jìn)行文庫(kù)制備，在Illumina HiSeq2500上測(cè)序，產(chǎn)生50bp的單端reads，并使用bwa與hg19進(jìn)行比對(duì)。使用Picard對(duì)重復(fù)進(jìn)行了標(biāo)記和重比對(duì)。使用MACS2對(duì)比對(duì)文件進(jìn)行peak calling，DiffBind被用來(lái)探索峰的重疊情況，并推導(dǎo)出共識(shí)峰集。通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣本條件下重復(fù)的reads平均數(shù)，對(duì)共有峰位點(diǎn)、MYC(髓細(xì)胞增生原癌基因)結(jié)合位點(diǎn)和AR(雄激素受體)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行讀長(zhǎng)分布分析，并使用t檢驗(yàn)比較樣本之間的分布中心值，以評(píng)估這些位點(diǎn)的染色質(zhì)開(kāi)放性差異。

4.單細(xì)胞RNA預(yù)處理和質(zhì)量控制CellRanger的輸出被用作Seurat的輸入，用于進(jìn)一步分析scRNA-seq樣品。對(duì)于每個(gè)樣品，根據(jù)檢測(cè)到的基因數(shù)量、檢測(cè)到的分子總數(shù)和來(lái)自線(xiàn)粒體基因組的reads百分比篩選出質(zhì)量差的細(xì)胞。為了解決數(shù)據(jù)中細(xì)胞周期異質(zhì)性的影響，使用Seurat CellCycleScoring函數(shù)對(duì)每個(gè)細(xì)胞的S期或G2/M期相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。使用sctransform對(duì)G2/M期和S期之間的評(píng)分差異進(jìn)行評(píng)估。在單細(xì)胞RNA聚類(lèi)中，研究者使用相互最近鄰方法fastMNN對(duì)4個(gè)LNCaP樣本進(jìn)行整合，使用了2000個(gè)整合特征并考慮了批次效應(yīng)。使用Seurat進(jìn)行聚類(lèi)和UMAP非線(xiàn)性降維。每個(gè)簇的特征基因和樣本間的差異表達(dá)基因是用Seurat的廣義線(xiàn)性模型MAST框架來(lái)識(shí)別的。如果Bonferroni校正的P值<0.01，簇中至少有10%的細(xì)胞表達(dá)該基因，且平均倍數(shù)變化至少為0.25，則該基因被認(rèn)為是差異表達(dá)的。此外，研究者利用MSigDB中的hallmark基因集，根據(jù)其差異表達(dá)的基因來(lái)表征聚類(lèi)和樣本。具體的步驟是使用GSVA包進(jìn)行了基因集變異分析(GSVA)，以表征每個(gè)聚類(lèi)的平均表達(dá)量。然后使用fgsea包對(duì)MSigDB hallmark基因集進(jìn)行基因集富集分析。使用cytoTRACE預(yù)測(cè)了每個(gè)樣本中每個(gè)細(xì)胞的分化潛能。使用scVelo評(píng)估了scRNA-seq樣本中單細(xì)胞的RNA速度。

5.單細(xì)胞ATAC預(yù)處理和質(zhì)量控制CellRanger ATAC流程的輸出被用作Signac軟件包的輸入，用于進(jìn)一步分析scATAC-seq樣品。對(duì)于每個(gè)樣品，篩選出劣質(zhì)細(xì)胞。使用Signac和潛在語(yǔ)義索引(LSI)進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化和降維。使用LSI嵌入的harmony方法對(duì)scATAC-seq樣本進(jìn)行整合聚類(lèi)。得到的結(jié)果被用作Signac軟件包的輸入，用于UMAP非線(xiàn)性降維和聚類(lèi)，使用默認(rèn)參數(shù)和SLM算法進(jìn)行模塊優(yōu)化。通過(guò)匯集每個(gè)樣品中所有優(yōu)質(zhì)細(xì)胞的reads，對(duì)scATAC-seq樣品中的染色質(zhì)可及性變化進(jìn)行分析。使用Signac中的TSSEnrichment函數(shù)生成轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的富集，CoveragePlot函數(shù)生成基于片段覆蓋率的染色質(zhì)可及性軌跡。使用ReactomePA評(píng)估Reactome通路的過(guò)表達(dá)。用Signac的邏輯回歸模型來(lái)識(shí)別聚類(lèi)中的差異可及區(qū)域，該模型根據(jù)每個(gè)基因來(lái)預(yù)測(cè)群組成員，并使用似然比檢驗(yàn)來(lái)比較結(jié)果和零模型，以峰的總數(shù)作為潛在變量。如果Bonferroni校正的p值<0.05，至少有10%的細(xì)胞在該區(qū)域顯示出可及性，并且平均倍數(shù)變化至少為0.25，則該區(qū)域被認(rèn)為是可及的。使用SignacClosestFeature函數(shù)用最接近的基因?qū)Σ町惪杉皡^(qū)域進(jìn)行注釋。使用R包ggradar對(duì)樣品間簇的差異可及區(qū)域進(jìn)行可視化。

6.scATAC-seq的轉(zhuǎn)錄因子基序富集和轉(zhuǎn)錄輸出使用R包TFBSTools、BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38和從RJASPAR2018數(shù)據(jù)包中檢索的JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)的位置-頻率矩陣，在樣品條件之間和每個(gè)樣品簇之間的差異可及染色質(zhì)區(qū)域中使用Signac進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子基序富集?？紤]到染色質(zhì)區(qū)域的序列特征(如GC頻率)，因此使用了超幾何檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)顯著性基序富集。通過(guò)評(píng)估富集的轉(zhuǎn)錄因子的靶基因和scRNA-seq簇中差異表達(dá)基因之間的重疊，將scATAC-seq中的染色質(zhì)狀態(tài)與scRNA-seq中的轉(zhuǎn)錄輸出相關(guān)聯(lián)。

7.基于標(biāo)簽轉(zhuǎn)移整合scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)集LNCaP，LNCaP-ENZ48，RES-A和RES-B的每個(gè)樣本都有scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)類(lèi)型使用Signac和Seurat中實(shí)現(xiàn)的聚類(lèi)-標(biāo)簽轉(zhuǎn)移程序進(jìn)行整合。每個(gè)scRNA-seq樣本被單獨(dú)聚類(lèi)，其聚類(lèi)標(biāo)簽被投射到匹配的，單獨(dú)聚類(lèi)的scATAC-seq樣本上，每個(gè)樣本的聚類(lèi)分辨率使用clustree進(jìn)行評(píng)估和確定。另外，RNA-seq的表達(dá)水平從scATAC-seq數(shù)據(jù)中推算出來(lái)。通過(guò)測(cè)試不同的預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)閾值，發(fā)現(xiàn)在所有樣本中，使用0.3的閾值，大約有50%以上的細(xì)胞在數(shù)據(jù)類(lèi)型之間進(jìn)行了標(biāo)簽轉(zhuǎn)移。

8.RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)分析使用GSVA包對(duì)每個(gè)基因特征或基因集進(jìn)行富集評(píng)估并在樣本中評(píng)分。在單細(xì)胞水平評(píng)估基因集表達(dá)的情況下，Seurat中的AddModuleScore函數(shù)被用來(lái)生成每個(gè)細(xì)胞的平均表達(dá)分?jǐn)?shù)。生存分析使用survival包進(jìn)行，Kaplan-Meier曲線(xiàn)使用survminer包繪制。對(duì)于單一特征的生存分析，使用中位GSVA評(píng)分將患者分為低表達(dá)和高表達(dá)的特征組。對(duì)于多個(gè)特征的生存分析，利用每個(gè)特征的GSVA富集分?jǐn)?shù)，使用歐氏距離和層次聚類(lèi)法對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)。聚類(lèi)結(jié)果隨后被用來(lái)確定生存分析中的兩組樣本。

9.原發(fā)性前列腺癌組織的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析從一名患者身上獲得了兩片冷凍的PC組織，在Illumina NovaSeqPE150測(cè)序儀上完成測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)首先用10xGenomics的SpaceRanger進(jìn)行處理，以獲得兩個(gè)部分的表達(dá)矩陣。然后用Seurat進(jìn)行下游處理和聚類(lèi)，用sctransform對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，以考慮測(cè)序深度差異。Seurat的AddModuleScore函數(shù)被用來(lái)對(duì)基因特征的spot進(jìn)行評(píng)分。研究者比較了管家基因集和scRNA-seq特征集的基因表達(dá)分?jǐn)?shù)分布，以確定第90個(gè)百分點(diǎn)作為cutoff，在這個(gè)分界點(diǎn)上把spot視為具有高表達(dá)的scRNA-seq特征。

研究結(jié)果

1. 染色質(zhì)重編程是恩雜魯胺耐藥的基礎(chǔ)

為了研究PC中AR信號(hào)抑制和耐藥動(dòng)力學(xué)的分子后果，利用LNCaP親本細(xì)胞系、LNCaP衍生的ENZ耐藥細(xì)胞系RES-A和RES-B，這些細(xì)胞系通過(guò)長(zhǎng)期暴露于A(yíng)R靶向藥物而產(chǎn)生，以及其他獨(dú)立生成的LNCaP和VCaP衍生模型(圖1a)。為了確定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)ENZ抗性的影響，對(duì)4個(gè)樣本進(jìn)行了scATAC測(cè)序(圖1a)。與親本細(xì)胞相比，ENZ抗性細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的ATAC-seq信號(hào)下降(圖1b)。這種趨勢(shì)也被發(fā)現(xiàn)在管家基因、雄性激素反應(yīng)通路的基因和參與MYC信號(hào)傳導(dǎo)的基因中，表明這種模式不限于一個(gè)特定的基因集。此外，與RES-B和LNCaP相比，RES-A細(xì)胞的獨(dú)特開(kāi)放位點(diǎn)比例更高(圖1c)。

圖片

研究者通過(guò)對(duì)親代LNCaP和RES-A細(xì)胞進(jìn)行FAIRE測(cè)序，證實(shí)了ENZ抗性細(xì)胞中染色質(zhì)開(kāi)放和重編程的程度。雖然開(kāi)放染色質(zhì)位點(diǎn)的總數(shù)沒(méi)有明顯差異，但與親代相比，在雄性激素存在和雄性激素匱乏的條件下，ENZ抗性樣本有更高比例的獨(dú)特開(kāi)放位點(diǎn)。接下來(lái)，研究者基于scATAC-seq樣本來(lái)生成具有不同染色質(zhì)可及性特征的細(xì)胞亞群的聚類(lèi)可視化(圖1d)，由此確定了各樣品中獨(dú)特或共享的簇(圖1e)。獨(dú)特的簇是專(zhuān)門(mén)針對(duì)RES-A和RES-B，共有的簇以相似的比例存在于樣本中，被命名為持續(xù)簇(圖1e)。將每個(gè)簇與其他所有的簇進(jìn)行比較，根據(jù)差異可及的染色質(zhì)區(qū)域(DAR)來(lái)確定其獨(dú)特的染色質(zhì)特征。就細(xì)胞數(shù)量而言，最普遍的基于染色質(zhì)的scATAC-seq簇是持續(xù)的(圖1e)，這表明在ENZ抗性的發(fā)展過(guò)程中，74%的細(xì)胞共享一個(gè)整體類(lèi)似的染色質(zhì)可及性譜。然后，評(píng)估了親代LNCaP、LNCaP-ENZ48以及RES-A和RES-B之間簇染色質(zhì)DAR的變化。在對(duì)恩雜魯胺的短效反應(yīng)期間，在幾個(gè)簇的MYC和TP53周?chē)^(guān)察到DAR。

已有研究表明，在無(wú)雄性激素的情況下長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的PC細(xì)胞系往往顯示出類(lèi)似神經(jīng)內(nèi)分泌的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RES-A和RES-B細(xì)胞中NEPC衍生的特征表達(dá)升高，以及原始簇中NEPC下調(diào)的基因表達(dá)升高。此外，在相同細(xì)胞系的RNA測(cè)序中，NEPC特征的基因集變異分析顯示，只有RES-A細(xì)胞中NEPC上調(diào)的基因表達(dá)量較高。這些數(shù)據(jù)顯示，在出現(xiàn)對(duì)AR靶向藥物的耐藥性過(guò)程中，染色質(zhì)發(fā)生了廣泛的重編程。

2. 恩雜魯胺的耐藥性重構(gòu)了染色質(zhì)中TF結(jié)合DNA基序的可用性

染色質(zhì)的可及性通過(guò)暴露TF DNA結(jié)合基序的軌跡來(lái)確定細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄輸出。根據(jù)reads分布分析，觀(guān)察到ENZ抗性細(xì)胞中MYC結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)放染色質(zhì)明顯增加(圖2a)，去勢(shì)條件下AR結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)放染色質(zhì)減少(圖2b)。這些發(fā)現(xiàn)表明，ENZ抗性的染色質(zhì)失調(diào)與AR和MYC染色質(zhì)結(jié)合的重構(gòu)有關(guān)，這與之前報(bào)道的一致。

圖片

為了解決染色質(zhì)重編程如何在單細(xì)胞水平上影響TF DNA基序的暴露，研究者對(duì)每個(gè)樣品中scATAC-seq細(xì)胞簇的標(biāo)記DAR進(jìn)行了TF基序富集分析(圖2c)。在RES-A和RES-B中，簇3和簇5富集了相同TF基序的子集，簇5在所有樣品中顯示出一致的富集趨勢(shì)(圖2c)。簇3以FOXA1和JUND為特征，而簇5以CTCF、ETS和MYC為特征，盡管它們擁有不同的DAR，但ENZ誘導(dǎo)的簇6和簇7在RES-A或RES-B中并沒(méi)有顯示出TF基序的富集。值得一提的是，MYC和ESR1分別是RES-A和RES-B中所有簇中最常見(jiàn)的(圖2d)。這些分析表明，ENZ耐藥性與TF DNA基序軌跡的重構(gòu)有關(guān)。

3. 恩雜魯胺耐藥性的轉(zhuǎn)錄模式由不同的染色質(zhì)重編程引起

為了研究與單細(xì)胞水平的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重組有關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式，對(duì)LNCaP親本、RES-A和-B模型進(jìn)行了scRNA-seq。4個(gè)LNCaP樣本的綜合聚類(lèi)(圖3a)顯示了7個(gè)持續(xù)、3個(gè)ENZ誘導(dǎo)和3個(gè)初始細(xì)胞簇，由標(biāo)記的差異表達(dá)基因集構(gòu)成(圖3b)。為了證實(shí)這些細(xì)胞亞群與ENZ抗性的其他獨(dú)立模型有關(guān)，使用標(biāo)簽轉(zhuǎn)移方法探索獨(dú)立scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的匹配細(xì)胞群。轉(zhuǎn)移scRNA-seq簇標(biāo)簽證實(shí)了LNCaP親代和RES-C中原始簇的存在，在RES-C和LNCaP-ENZ168中證實(shí)了ENZ誘導(dǎo)簇的存在。

圖片

由于大多數(shù)scATAC-seq簇的細(xì)胞比例與scRNA-seq的簇3細(xì)胞相對(duì)應(yīng)(圖3e)，這表明該簇的細(xì)胞可能代表了ENZ抗性的基因組。對(duì)VCaP細(xì)胞的分析證實(shí)了VCaP親代細(xì)胞以及VCaP-ENZ48的原始和ENZ誘導(dǎo)細(xì)胞的普遍性(圖3c)。接下來(lái)，將scRNA-seq簇與其匹配的scATAC-seq簇連接起來(lái)，再次利用標(biāo)簽轉(zhuǎn)移的方法，在相同的樣本條件下確定匹配的scRNA-seq和scATAC-seq細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一個(gè)染色質(zhì)狀態(tài)可以對(duì)應(yīng)多個(gè)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。通過(guò)探索scATAC-seq數(shù)據(jù)中的scRNA-seq簇，結(jié)果可以在scRNA中找到所有scATAC簇的匹配細(xì)胞狀態(tài)，其中scATAC簇中的細(xì)胞通常對(duì)應(yīng)于多個(gè)scRNA簇(圖3d-e)?？傊@些數(shù)據(jù)表明，ENZ抗性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄構(gòu)型，特別是在治療期間的持續(xù)細(xì)胞，是由染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和TF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重編程驅(qū)動(dòng)過(guò)程產(chǎn)生的，這些過(guò)程影響許多的細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)因子。

4. 具有干性特征的前列腺癌細(xì)胞亞群先于恩雜魯胺耐藥

細(xì)胞周期階段可能是scRNA-seq數(shù)據(jù)整合聚類(lèi)的一個(gè)重要決定因素。在Seurat中使用細(xì)胞周期評(píng)分法，持續(xù)簇8、9和11的S期和G2/M期相關(guān)基因得分很高(圖4a)，表明這些簇中的細(xì)胞循環(huán)和增殖更為活躍。然而，簇11中的細(xì)胞不僅具有細(xì)胞周期基因的特征，還參與染色質(zhì)重塑等過(guò)程(圖4b)。簇5和11顯示了一個(gè)基因集的高表達(dá)，該基因集表征了具有干細(xì)胞樣、雄激素不敏感和細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)特征的細(xì)胞亞群(圖4c)，將這一基因特征命名為Persist。另外，在親代LNCaP的ENZ治療前，原始簇10對(duì)PC相關(guān)基因特征的評(píng)分很高，并將其命名為PROSGenesis(圖4d)。最后，將PROSGenesis和Persist基因在scRNA-seq樣品中的表達(dá)進(jìn)行了可視化，以證實(shí)這些亞群細(xì)胞在其他模型中的存在(圖4e)。

圖片

使用CytoTRACE根據(jù)表達(dá)基因的數(shù)量估計(jì)分化狀態(tài)，在大多數(shù)樣品中，簇11中的細(xì)胞顯示出高發(fā)展?jié)摿?圖4f)，表明其他細(xì)胞亞群可以從該簇的細(xì)胞中衍生出來(lái)。RNA速度分析預(yù)測(cè)簇10是恩雜魯胺誘導(dǎo)的簇前體(圖4g)。RES-A和RES-B的簇差速分析顯示，許多PC相關(guān)基因如ATAD2下調(diào)，以及UBE2T等基因的上調(diào)。另外，ATAD2和UBE2T在持續(xù)簇8、9和11中上調(diào)，這表明在ENZ誘導(dǎo)的簇中發(fā)生了額外的轉(zhuǎn)錄重編程。這些分析得出了ENZ耐藥之前兩個(gè)不同的PC細(xì)胞亞群：一個(gè)與Persist匹配的持續(xù)細(xì)胞簇(簇11)和一個(gè)與PROSGenesis匹配的原始簇(簇10)。

5. 前列腺癌RNA測(cè)序中基因特征的表征

根據(jù)基因組變異分析，大多數(shù)持續(xù)簇和簇10顯示E2F靶點(diǎn)、G2M檢查點(diǎn)和MYC靶基因的富集，表明在RNA-seq數(shù)據(jù)中可以檢索到細(xì)胞亞群的信號(hào)。簇內(nèi)的差異表達(dá)和基因集富集分析進(jìn)一步顯示，氧化磷酸化在LNCaP-ENZ48中被上調(diào)，這一過(guò)程在RES-A中被選擇性的維持，但在RES-B細(xì)胞中未被維持。此外，在ENZ耐藥性的產(chǎn)生過(guò)程中，受活化mTORC1信號(hào)調(diào)節(jié)的基因在大多數(shù)簇中一致上調(diào)，這與之前的報(bào)道一致。大部分情況下，ENZ誘導(dǎo)的DEG選擇性地出現(xiàn)在RES-B細(xì)胞中。同樣，當(dāng)用DHT誘導(dǎo)時(shí)，持續(xù)簇只在RES-A和RES-B中與持續(xù)特征相關(guān)。另一方面，PROSGenesis特征僅在RES-B中升高(圖5)。總的來(lái)說(shuō)，持續(xù)簇，原始簇，PROSGenesis和Persist基因特征具有從RNA-seq來(lái)識(shí)別前列腺癌侵襲性、再生特征的潛力。

圖片

6. 轉(zhuǎn)錄信號(hào)富集分析識(shí)別了前列腺癌患者的治療持續(xù)細(xì)胞和預(yù)后基因特征

研究者獲得了已有研究ENZ治療CRPC患者的臨床數(shù)據(jù)，對(duì)單個(gè)基因特征的PFS分析顯示，Persist特征基因得分較高的患者與PFS較短有關(guān)(圖5c，d)，而PFS較長(zhǎng)的患者在PROSGenesis和原始簇特征上得分高。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)ENZ耐藥的單細(xì)胞分析中，與持續(xù)細(xì)胞(簇11)相關(guān)的Persist特征是一個(gè)有效的分類(lèi)器，可能對(duì)患者進(jìn)行分層，以確定對(duì)AR靶向治療的反應(yīng)(圖5f)。此外，研究者基于最近發(fā)表的PC相關(guān)的scRNA-seq數(shù)據(jù)集，分析顯示與成纖維細(xì)胞相比，LNCaP模型衍生細(xì)胞簇在管腔和基底/中間細(xì)胞中得分更高。此外，與基底/中間細(xì)胞和原始細(xì)胞相比，管腔細(xì)胞具有更高的與原始scRNA-seq簇相關(guān)的基因表達(dá)。然后，對(duì)來(lái)自Persist和PROSGenesis特征的基因表達(dá)細(xì)胞及其相關(guān)簇和一些對(duì)照特征進(jìn)行評(píng)分(圖6b)。在Persist特征評(píng)分較高的細(xì)胞中，約48%為管腔細(xì)胞(圖6c)。在PROSGenesis特征中得分較高的細(xì)胞大多為基底細(xì)胞/中間細(xì)胞(圖6d)。每個(gè)腫瘤平均有8%的細(xì)胞在Persist和PROSGenesis特征上得分較高(圖6e)。

圖片

為了探索這些細(xì)胞的存在和它們的相對(duì)組織病理學(xué)位置，用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)評(píng)估了原發(fā)性PC切片內(nèi)的基因表達(dá)(前列腺A和B)，利用聚類(lèi)分析重建了基質(zhì)和上皮成分的基因表達(dá)信號(hào)，并在基質(zhì)組織(ST)、良性上皮(BE)和腺癌(PC-AC)的5個(gè)簇中注釋了組織結(jié)構(gòu)(圖6f)。PROSGenesis和Persist特征，以及伴隨模型衍生的簇10特征，與來(lái)自管家基因特征的分?jǐn)?shù)相比，在切片內(nèi)顯示出高表達(dá)分?jǐn)?shù)(圖6g)。在兩個(gè)切片中，高信號(hào)的spot分布在所有5個(gè)簇中(圖6h)。然而在前列腺A中，與ST相比，PC-AC簇中 Persist 特征得分高的spot更為普遍(圖6h)。這些數(shù)據(jù)表明，在PC患者未經(jīng)治療的原發(fā)性前列腺組織中，存在著治療的持續(xù)細(xì)胞，具有很高的轉(zhuǎn)移潛力。

圖片

最后，研究者驗(yàn)證了是否能利用從這些細(xì)胞中提取的特征基因預(yù)測(cè)原發(fā)性PC患者的復(fù)發(fā)，由此獲得了原發(fā)性腫瘤TCGA PRAD(圖7a)和早發(fā)性PC ICGC RNA-seq數(shù)據(jù)。使用所有特征進(jìn)行聚類(lèi)，TCGA PRAD隊(duì)列分離出54%的GS(Gleason分級(jí))-7和15%的GS-8+患者，他們不會(huì)從額外的治療中受益，因?yàn)樗麄兊念A(yù)后相對(duì)較好(圖7b)，在ICGC隊(duì)列中也觀(guān)察到類(lèi)似的趨勢(shì)。在TCGA隊(duì)列中，ENZ誘導(dǎo)的簇(圖7c)、PROSGenesis(圖7d)、Persist(圖7e)和持續(xù)簇(圖7f)基因特征是簇分離的最重要因素，而NEPC下調(diào)基因是ICGC隊(duì)列的主要決定因素。這些腫瘤中反映AR活性的特征在TCGA隊(duì)列中與較長(zhǎng)的進(jìn)展時(shí)間相關(guān)(圖7g，h)，表明AR驅(qū)動(dòng)的腫瘤對(duì)AR信號(hào)的抑制有更好的反應(yīng)。在早發(fā)性PC隊(duì)列中，與TCGA PRAD隊(duì)列相比，持續(xù)簇和PROSGenesis特征對(duì)GS-7患者進(jìn)行了顯著的分層，表明這些特征能夠進(jìn)一步確定基于GS的患者風(fēng)險(xiǎn)分層，避免過(guò)度治療。高PROSGenesis評(píng)分與良好的預(yù)后以及來(lái)自原始簇10的基因集相關(guān)(圖7i)。在TCGA隊(duì)列中，13個(gè)簇衍生特征中有8個(gè)與PFS相關(guān)(圖7i)，表明這些特征在PC患者風(fēng)險(xiǎn)分層中的重要作用。

展望

關(guān)于前列腺癌，對(duì)大多數(shù)研究者來(lái)說(shuō)還真是一個(gè)既熟悉又神秘的癌種。熟悉是因?yàn)闆](méi)年都有很多關(guān)于前列腺癌的相關(guān)研究，但是通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)追蹤就會(huì)發(fā)現(xiàn)，其中有很多都是直接研究腫瘤細(xì)胞，以及各種藥物的作用。而之所以又說(shuō)它神秘是因?yàn)?，作為?0年腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，腫瘤免疫微環(huán)境的研究是很多其它腫瘤的常見(jiàn)套路，但是卻在前列腺癌中很少見(jiàn)。難道是因?yàn)榍傲邢侔┲胁唤?rùn)免疫細(xì)胞嗎？但是好像又不是，因?yàn)橐认侔┲幸膊蝗菀捉?rùn)免疫細(xì)胞，但是我們依然可以研究胰腺癌中各種免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)。

既然沒(méi)有腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)研究，那有關(guān)前列腺癌癌的免疫治療的相關(guān)報(bào)道我們更難見(jiàn)到。對(duì)此，小編也和專(zhuān)門(mén)做前列腺癌的小伙伴聊過(guò)這件事，他也給不出很好的解釋。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，歡迎研究前列腺癌方向且有相關(guān)想法的小伙伴通過(guò)后臺(tái)與我們聯(lián)系。

[參考文獻(xiàn)]

Taavitsainen S, Engedal N, Cao S, Handle F, Erickson A, Prekovic S, Wetterskog D, Tolonen T, Vuorinen EM, Kiviaho A, N?tkin R, H?kkinen T, Devlies W, Henttinen S, Kaarij?rvi R, Lahnalampi M, Kaljunen H, Nowakowska K, Syv?l? H, Bl?uer M, Cremaschi P, Claessens F, Visakorpi T, Tammela TLJ, Murtola T, Granberg KJ, Lamb AD, Ketola K, Mills IG, Attard G, Wang W, Nykter M, Urbanucci A. Single-cell ATAC and RNA sequencing reveal pre-existing and persistent cells associated with prostate cancer relapse. Nat Commun. 2021 Sep 6;12(1):5307. doi: 10.1038/s41467-021-25624-1. PMID: 34489465; PMCID: PMC8421417.