作者：Resther
審稿：童蒙
編輯：angelica

1.背景介紹

人體淋巴細(xì)胞主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞。B細(xì)胞約占外周淋巴細(xì)胞總數(shù)的20%，其主要功能是產(chǎn)生抗體介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。

B細(xì)胞抗原受體（B cell receptor, BCR）是B細(xì)胞識(shí)別抗原的一種膜表面免疫球蛋白，具有抗原結(jié)合特異性。BCR由兩條重鏈和兩條輕鏈連接而成，其中重鏈分為可變區(qū)（V區(qū)）、恒定區(qū)（C區(qū)）、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)；輕鏈則只有V區(qū)和C區(qū)。V區(qū)由VH和VL兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，它們各由三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1、CDR2和CDR3）組成，CDR的氨基酸組成和排列順序呈現(xiàn)高度多樣性。

在同一個(gè)體內(nèi)，可高達(dá)10⁹～10¹²，構(gòu)成容量巨大的BCR庫(kù)，賦予個(gè)體識(shí)別各種抗原、產(chǎn)生特異性抗體的巨大潛能，這三個(gè)CDR均參與對(duì)抗原的識(shí)別，共同決定BCR的抗原特異性。

T細(xì)胞主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞免疫。T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）是T細(xì)胞特異性識(shí)別和結(jié)合抗原肽-MHC分子的分子結(jié)構(gòu)，大多數(shù)TCR由α和β肽鏈組成，少數(shù)T細(xì)胞的TCR由γ和δ肽鏈組成。每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)(C區(qū))，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分，而α和β兩條肽鏈的V區(qū)（Vα、Vβ）又各有三個(gè)高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3變異最大，直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。TCR的CDR3由V、D、J三個(gè)基因編碼，在淋巴細(xì)胞的成熟過(guò)程中，通過(guò)V、D、J基因的重排形成了各種重組序列片段，再加上DNA堿基的SNP、Indel突變形成了T細(xì)胞的多樣性。

免疫組庫(kù)（Immune Repertoire，IR）是指某個(gè)個(gè)體在任何特定時(shí)間點(diǎn)其循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的總和，擁有6種主要的肽鏈，分別為BCR的輕鏈和重鏈、TCR的α、β、γ和δ鏈。免疫組庫(kù)中每一種免疫蛋白彼此間結(jié)構(gòu)差異很小，但亞型種類(lèi)繁多，正是這種多樣性對(duì)健康起著至關(guān)重要的作用，免疫蛋白的亞型越多，越能有效抵抗病原體，亞型越少越容易感染疾病。除此之外，其它很多年齡、環(huán)境、疾病誘發(fā)以及用藥等因素也影響著免疫組庫(kù)的多樣性。免疫組庫(kù)反映機(jī)體免疫系統(tǒng)在特定時(shí)間段內(nèi)應(yīng)對(duì)外界刺激應(yīng)答的能力。

從群體的角度講，人類(lèi)的免疫大分子的多樣性是十分可觀的，因?yàn)槿祟?lèi)幾乎能對(duì)所有外來(lái)感染源產(chǎn)生免疫反應(yīng)?？墒窃趥€(gè)體水平，我們的免疫組庫(kù)的大小就有限了。

個(gè)體免疫組庫(kù)的內(nèi)容受三個(gè)因素的控制：遺傳因素；抗原接觸史；時(shí)時(shí)刻刻的免疫調(diào)控。個(gè)體化的免疫組庫(kù)研究可以用來(lái)做疾病相關(guān)性研究，例如尋找Biomarker，對(duì)疾病機(jī)理進(jìn)行一個(gè)全新角度的探討，也可以促進(jìn)對(duì)更多疾病的早期診斷、治療甚至預(yù)防，可應(yīng)用于疫苗和醫(yī)藥的研發(fā)、生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、微小殘留?。∕inimal Residual Disease,MRD）檢測(cè)、自身免疫性疾病的研究以及移植后監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，例如在疾病特異的生物標(biāo)志物的研究中，可通過(guò)高通量測(cè)序在患有同種疾病的人群中找到疾病特異性的CDR3，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后的這些CDR3序列就可以作為代表該病的并可以從外周血中查到的Biomarker；自身免疫性疾病的研究如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可以通過(guò)高通量測(cè)序識(shí)別潛在自體反應(yīng)克隆來(lái)定量早期或已確診的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的外周血的T細(xì)胞組庫(kù)，作為早期診斷用藥的依據(jù)；關(guān)于疫苗的研發(fā)，我們可以通過(guò)分析不同年齡段的人群注射疫苗后的效果來(lái)促進(jìn)針對(duì)不同人群的疫苗研發(fā)；對(duì)于腫瘤研究，我們可通過(guò)比較患者用藥前后免疫組庫(kù)的變化來(lái)監(jiān)測(cè)疾病、指導(dǎo)用藥，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

研究者可以通過(guò)免疫組庫(kù)測(cè)序（Immune Repertoire sequencing, IR-seq）全面評(píng)估免疫系統(tǒng)的多樣性。該方法是以T/B淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，以多重PCR或5’RACE技術(shù)目的擴(kuò)增決定B細(xì)胞受體（BCR）或T細(xì)胞受體（TCR）多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，可以深入挖掘免疫組庫(kù)與疾病的關(guān)系。

然而這種方法價(jià)格昂貴，而且需要珍貴的組織樣本。于是研究者另辟蹊徑，考慮到組織或者外周血（PBMC）中包含有表達(dá)的TCR和BCR序列，劉小樂(lè)課題組中Li Song等人在2021年6月開(kāi)發(fā)了TRUST4工具，可以從組織或者外周血的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)中挖掘免疫組庫(kù)信息。早在2017年3月，該課題組開(kāi)發(fā)出TRUST（Tcr Receptor Utilities for Solid Tissue）方法，TRUST4性能比TRUST有了更大的提升，既支持FASTQ格式，也支持BAM格式，并且在組裝更長(zhǎng)、甚至是全長(zhǎng)受體庫(kù)方面是更快、更靈敏的。TRUST4還可以從沒(méi)有V(D)J富集的單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）數(shù)據(jù)中獲取組庫(kù)序列，并對(duì)SMART-seq和10× Genomics平臺(tái)都是兼容的。

2.運(yùn)行原理

TRUST首先將所測(cè)reads比對(duì)到參考基因組上，將比對(duì)上的reads組裝成contigs，然后根據(jù)IMGT(International Immunogenetics Information System)進(jìn)行注釋：

具體細(xì)節(jié)可以參考下面這張圖：

3.方法效果

首先對(duì)于bulk的RNA-seq數(shù)據(jù)，研究者在已知TRB序列生成的RNA-seq數(shù)據(jù)上使用了三種不同的方法，發(fā)現(xiàn)TRUST4比MiXCR多找出281%的CDR3s，比CATT多找出22.9%，比TRUST3多找出57.8%的CDR3s。接著，為了評(píng)估對(duì)BCRs的尋找效率，在有BCR-seq作為金標(biāo)準(zhǔn)的6個(gè)腫瘤RNA-seq數(shù)據(jù)上，TRUST4在5個(gè)數(shù)據(jù)上表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確率和敏感性，同時(shí)只需要MiXCR所需20~25%的運(yùn)行時(shí)間。最后，在全長(zhǎng)組裝方面，TRUST4和MiXCR都能檢測(cè)出全部128個(gè)CDR3s，但是TRUST4可以組裝出93個(gè)，而MiXCR只能組裝出39個(gè)。

在單細(xì)胞數(shù)據(jù)上，研究者也做了一系列評(píng)估。在測(cè)試數(shù)據(jù)上，TRUST4可以檢測(cè)到48.1%的TCR CDR3s和78.0%的BCR CDR3s。TRUST4比CellRanger_VDJ時(shí)間快10倍，節(jié)省2倍多的空間。

4.安裝使用

TRUST4的安裝非常簡(jiǎn)單，直接下載代碼網(wǎng)址：https://github.com/liulab-dfci/TRUST4
git clone https://github.com/liulab-dfci/TRUST4.git
然后在下載的代碼所在的文件夾中運(yùn)行make 或者用conda安裝：
conda install -c bioconda trust4
安裝好之后，我們就可以使用TRUST4了。

Usage: ./run-trust4 [OPTIONS]
  Required:
    -b STRING: path to bam file
    -1 STRING -2 STRING: path to paired-end read files
    -u STRING: path to single-end read file
    -f STRING: path to the fasta file coordinate and sequence of V/D/J/C genes
  Optional:
    --ref STRING: path to detailed V/D/J/C gene reference file, such as from IMGT database. (default: not used). (recommended) 
    -o STRING: prefix of output files. (default: inferred from file prefix)
    --od STRING: the directory for output files. (default: ./)
    -t INT: number of threads (default: 1)
    --barcode STRING: if -b, bam field for barcode; if -1 -2/-u, file containing barcodes (defaul: not used)
    --barcodeRange INT INT CHAR: start, end(-1 for lenght-1), strand in a barcode is the true barcode (default: 0 -1 +)
    --barcodeWhitelist STRING: path to the barcode whitelist (default: not used)
    --read1Range INT INT: start, end(-1 for length-1) in -1/-u files for genomic sequence (default: 0 -1)
    --read2Range INT INT: start, end(-1 for length-1) in -2 files for genomic sequence (default: 0 -1)
    --mateIdSuffixLen INT: the suffix length in read id for mate. (default: not used)
    --skipMateExtension: do not extend assemblies with mate information, useful for SMART-seq (default: not used)
    --abnormalUnmapFlag: the flag in BAM for the unmapped read-pair is nonconcordant (default: not set)
    --noExtraction: directly use the files from provided -1 -2/-u to assemble (default: extraction first)
    --repseq: the data is from TCR-seq or BCR-seq (default: not set)
    --stage INT: start TRUST4 on specified stage (default: 0)
      0: start from beginning (candidate read extraction)
      1: start from assembly
      2: start from annotation
      3: start from generating the report table

TRUST4的輸入文件主要有三個(gè)：

• （1） RNA-seq的測(cè)序文件，可以是bam文件，-b，或者是fastq格式，雙端測(cè)序用-1/-2，單端測(cè)序是-u。
• （2）包含V，J，C基因的基因序列和坐標(biāo)，-f，網(wǎng)站已經(jīng)提供了hg38_bcrtcr.fa和hg19_bcrtcr.fa
• （3）包含注釋信息的參考數(shù)據(jù)庫(kù)序列，--ref，比如IMGT

下載IMGT序列文件：
perl BuildImgtAnnot.pl Homo_sapien > IMGT+C.fa
這一步會(huì)從IGMT網(wǎng)站下載：

參考文獻(xiàn)

Song, L., Cohen, D., Ouyang, Z. et al. TRUST4: immune repertoire reconstruction from bulk and single-cell RNA-seq data. Nat Methods (2021).