??SDS-PAGE是蛋白質(zhì)分析與鑒定最常用的方法之一，它的特點是一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與遷移率線性相關，基于這一點，很多技術(shù)人員把SDS-PAGE作為定量檢測分子量的手段。實際上，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的表觀分子量與實際分子量往往有偏差，本文主要聊聊包括分子量偏差在內(nèi)的三個問題：

1. 不同蛋白質(zhì)之間能進行分子量比較的原理
   ??關于SDS-PAGE的原理，網(wǎng)上有很多，千篇一律：在聚丙烯酰胺凝膠中，蛋白質(zhì)的泳動速率與電荷和體積有關，SDS與蛋白質(zhì)形成復合物，大量SDS所攜帶負電荷掩蓋了蛋白質(zhì)原有電荷，并且蛋白質(zhì)-SDS復合體具有相似的形狀（類似雪茄煙的棒狀顆粒，我個人認為應該比喻為橄欖球狀），電荷的差異消除了，形狀也相似，那只有分子量這一個變量了。分子量大的，“個頭”大，在凝膠中“行動遲緩”，分子量小的，“個頭”小，遷移速率快。實驗證明，在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的遷移速率與分子量的對數(shù)存在線性關系。
   這里有幾篇文獻，介紹了SDS-PAGE技術(shù)是如何確立的：
   [1] Laver W G. Structural studies on the protein subunits from three strains of influenza virus[J]. Journal of molecular biology, 1964, 9(1): 109-IN9.
   研究人員使用SDS將三種病毒蛋白的亞基解離并通過電泳進行鑒別（這是作者找到的最早使用SDS-PAGE分析多肽鏈的文獻）
   [2] Shapiro, A. L., Vi?uela, E., & V. Maizel, J. (1967). Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochemical and Biophysical Research Communications, 28(5), 815–820.
   這篇文獻就是SDS-PAGE技術(shù)的起源了，Shapiro等研究了十幾種蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的遷移距離，發(fā)現(xiàn)遷移率與分子量對數(shù)存在線性關系。
   [3] Pitt-Rivers R, Impiombato F S A. The binding of sodium dodecyl sulphate to various proteins[J]. Biochemical Journal, 1968, 109(5): 825-830.
   研究了不同類型蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的數(shù)量比例關系。
   [4] Reynolds J A, Tanford C. The gross conformation of protein-sodium dodecyl sulfate complexes[J]. Journal of Biological Chemistry, 1970, 245(19): 5161-5165.
   研究了蛋白質(zhì)-SDS的構(gòu)象及其流體動力學性質(zhì)，給出了遷移速率與分子量線性關系的物理學解釋。
   [5] Mattice W L, Riser J M, Clark D S. Conformational properties of the complexes formed by proteins and sodium dodecyl sulfate[J]. Biochemistry, 1976, 15(19): 4264-4272.
   主要從二級結(jié)構(gòu)上解析SDS-PAGE復合物構(gòu)象，比較了不同復合物模型，提出新的模型解釋SDS-PAGE中部分堿性蛋白表觀分子量偏低的原因。
   ??SDS-PAGE是從上世紀60年代初發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，當時主要用于病毒蛋白、糖體蛋白和血清蛋白的研究[1]。1967年，Shapiro等[2]將該技術(shù)應用于蛋白質(zhì)分子量分析，此后這種方法逐漸普遍起來。在研究中，Shapiro等先用1%的SDS處理蛋白質(zhì)，再通過透析置換到0.1%SDS的磷酸緩沖液中，最后在0.1%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色得到蛋白質(zhì)的遷移結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的遷移速率與分子量對數(shù)之間存在很好的線性擬合，如下圖：
   
   Shapiro, A. L., Vi?uela, E., & V. Maizel, J., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1967, 28(5), 815–820.
   
   ??1968年，ROSALIND等[3]等研究發(fā)現(xiàn)，在一定pH和鹽離子濃度下，SDS結(jié)合蛋白質(zhì)具有比較固定的比例，并且這一比例與蛋白質(zhì)種類有關：對于部分糖蛋白，1g蛋白質(zhì)結(jié)合0.7~1g SDS；對于不含二硫鍵的蛋白，1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS；含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，1g蛋白質(zhì)結(jié)合0.7~0.9g SDS，二硫鍵被還原后，1g蛋白結(jié)合1.4g SDS。1970年，Reynolds等研究了SDS-蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu)，分析了“棒狀”復合物的流體動力學特征，得出復合物的特征粘度與分量子存在指數(shù)關系，可以進一步推導出復合物的斯托克斯半徑的對數(shù)與分子量對數(shù)存在線性關系。這幾篇論文基本上奠定了SDS-PAGE的理論基礎，感興趣的同學可以好好看看。

2. 表觀分子量大于或小于實際分子量的成因
   ??在SDS-PAGE上遷移率發(fā)生異常，是家常便飯，不論是酸性蛋白還是堿性蛋白，都會因為它們的固有電荷改變了SDS-PAGE的荷質(zhì)比而偏離正常值。一般認為，酸性蛋白富含負電荷可能遷移較快，堿性蛋白質(zhì)可能遷移較慢，事實并非如此，比如上圖中，RNase A和溶菌酶表觀分子量都小于實際分子量，這兩個蛋白質(zhì)都屬于堿性蛋白。為什么出現(xiàn)這樣的偏差呢？Mattice等[5]在他們的模型中給出了解釋：RNase A、組蛋白等堿性蛋白與SDS形成復合物后，仍含有大量緊密的螺旋結(jié)構(gòu)而不是松散的無規(guī)則卷曲，緊密的構(gòu)型使復合物在凝膠中有更小的阻力，因此遷移的更快。這一研究也表明，SDS-蛋白質(zhì)復合物并非都是無差別的“棒狀”結(jié)構(gòu)，這樣導致不同蛋白質(zhì)分子量對數(shù)與遷移率有更復雜的關系。
   ??用SDS-PAGE評估相對分子量是需要嚴格條件的：1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氨基酸構(gòu)成要接近，ROSALIND等的研究已經(jīng)證明，不同的蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的能力是不同的，使用相同的條件處理不同類型的蛋白質(zhì)，遷移偏差是必然的；2）蛋白質(zhì)要處于相同的溶劑環(huán)境，有些樣品處于高鹽溶液，有些處于低鹽環(huán)境，有時pH也有極大差異，即使經(jīng)過相同的SDS-PAGE loading buffer處理，蛋白質(zhì)結(jié)合SDS-PAGE的情況也可能有很大差別；3）分子量參照的影響，現(xiàn)在很多蛋白質(zhì)marker使用預染色marker，有色染料會在一定程度上影響遷移的準確性，如果需要比較準確的估算相對分子量，推薦使用非預染色marker。
   ??此外蛋白質(zhì)修飾也會影響遷移率，通?？梢砸姷搅姿峄瘜е碌鞍踪|(zhì)的遷移減慢，雖然磷酸根增加了蛋白質(zhì)的負電荷，但多半由于構(gòu)象變化和電荷排斥導致SDS結(jié)合減少，遷移減慢，這種情況一般經(jīng)過去磷酸化處理后，遷移速率能夠恢復。另一種典型的修飾是糖基化修飾，這個影響很大，除了糖基化蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的能力下降外，糖基改變了蛋白質(zhì)斯托克斯半徑，遷移速率往往有較大的減慢，如下圖：

   
   
   Shaw M L, Stone K L, Colangelo C M, et al. Cellular proteins in influenza virus particles[J]. PLoS pathogens, 2008, 4(6): e1000085.
   
   

   圖中l(wèi)ane1 為未經(jīng)處理的蛋白，lane2為去糖基化的蛋白，糖基化蛋白質(zhì)的表觀分子量顯著高于實際，而去糖基化處理后基本上恢復正常。組氨酸標簽融合常用于蛋白質(zhì)的分離純化，細心的技術(shù)人員可能會發(fā)現(xiàn)，末端融合組氨酸標簽后，表觀分子量往往會變大，這主要是正電荷增加導致的。組氨酸融合蛋白質(zhì)不同于組蛋白，末端的組氨酸一般不會影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但末端氨基酸殘基對等電點卻有很大影響，分析一些等電點計算軟件的開源代碼，不難發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)兩端氨基酸在計算等電點時有更高的權(quán)重。
   ??除了上面羅列的這些情況，一些金屬離子依賴的酶，在SDS存在時仍有結(jié)合金屬離子的能力，如鈣調(diào)蛋白質(zhì)，有沒有Ca2+離子，表觀分子量差異極大。因此，在進行蛋白質(zhì)分析時，如果需要比較準確的分析蛋白質(zhì)分子量最好選擇質(zhì)譜；要鑒定蛋白時，如果是酶最直接的方法的是活性鑒定，如果是其他蛋白質(zhì)（抗原、抗體、細胞因子等）可以選擇western blot，IP等免疫學方法，SDS-PAGE只能作為一種輔助驗證方法，不能作為唯一判斷標準。

3. 經(jīng)過SDS、還原劑、高溫處理得到的一定是單亞基嗎？

   
   
   Kado Y, Inoue T, Ishikawa K. Structure of hyperthermophilic β-glucosidase from Pyrococcus furiosus[J]. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2011, 67(12): 1473-1479.
   
   

   ??這是Kado等研究強烈火球菌超嗜熱β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果，酶經(jīng)2% SDS，710 mM β-巰基乙醇，95℃處理20min，蛋白質(zhì)依然以二聚體形態(tài)出現(xiàn)。在常規(guī)的還原型SDS-PAGE中，SDS主要破環(huán)氫鍵和疏水作用，β-巰基乙醇還原二硫鍵，高溫破環(huán)三維結(jié)構(gòu)也使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，但這并不是必然的。一些多聚體蛋白質(zhì)，有極強的分子間相互作用（氫鍵、鹽橋、疏水作用），SDS、還原劑、高溫處理并不能完全破壞這種作用，無法得到單亞基，所以有時看到電泳結(jié)果上出現(xiàn)倍數(shù)關系的條帶，可能是蛋白質(zhì)亞基未完全解離所致。對亞基間邊界作用分析感興趣的可以參考《體外分子進化改善β-葡萄糖苷酶酶學特性》一文中第六章的內(nèi)容。