希望可以認(rèn)識(shí)志同道合的學(xué)習(xí)和研究的小伙伴。有一個(gè)最近日更的公眾號(hào)（疫情期間在家更新很勤，以后開(kāi)學(xué)了大概2-3天更新一篇學(xué)習(xí)筆記，文獻(xiàn)閱讀或者其他隨筆，分子生物學(xué)，病毒學(xué)方向）——番茄隨筆（二維碼在個(gè)人主頁(yè)），歡迎關(guān)注，歡迎留言，我們一起討論問(wèn)題呀。
一、前言：
分子生物學(xué)著重于分子機(jī)制的研究，即基因與基因組的結(jié)構(gòu)和功能，生物大分子執(zhí)行功能的過(guò)程。這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展源于工具和方法的發(fā)展，每一場(chǎng)技術(shù)革命都讓分子生物學(xué)煥發(fā)新生。
時(shí)間久遠(yuǎn)的書(shū)和文獻(xiàn)里面的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在大多被當(dāng)成了技術(shù)在應(yīng)用，每每看到都讓我感慨科學(xué)的成長(zhǎng)和活力；也慚愧自己站在巨人的肩膀上，卻只是數(shù)著腳下的沙礫，并沒(méi)能遠(yuǎn)眺前方。
從第一次猜想DNA結(jié)構(gòu)，到第一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶和質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，再到新技術(shù)用于探測(cè)和擴(kuò)增DNA。我們穩(wěn)步進(jìn)入了全基因組時(shí)代，甚至后基因組時(shí)代，各種組學(xué)層出不窮......
二、翻翻分子生物學(xué)家的工具箱
1.克隆（clone）：獲得目的基因。
2.表達(dá)（expression）：表達(dá)新性狀或者收獲目的蛋白。
3.核酸酶（nuclease）：能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，稱(chēng)為核酸酶。
（1） 核酸外切酶（exonuclease ）：核酸外切酶是一類(lèi)從多核苷酸鏈的末端開(kāi)始逐個(gè)降解核苷酸的酶。比如exoⅠ，exoⅢ，exoⅦ，λexo等。
（2） 核酸內(nèi)切酶（endonuclease）：可水解分子鏈內(nèi)部磷酸二酯鍵生成寡核苷酸的酶，與核酸外切酶相對(duì)應(yīng)。例如DNaseⅠ，DNaseⅡ，RNase、RNaseT1等。前兩個(gè)定義拋磚引玉，下面看應(yīng)用最為廣泛的：
（3） 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：是可以識(shí)別并附著特定的脫氧核苷酸序列，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類(lèi)酶，簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶，有三種類(lèi)型。如Bam H，EcoRⅠ，EcoRⅡ，HindⅡ，HindⅢ，HpaI，HpaⅡ，MboI，MboⅡ等，細(xì)菌是其主要來(lái)源。酶的識(shí)別序列，切割位點(diǎn)以及產(chǎn)生的末端都不同。我覺(jué)得它是分子試驗(yàn)中最重要的工具。
（4） 限制性酶切位點(diǎn)分布圖（restriction map）：又叫物理圖譜（physical map）如果我們有一段已知序列，就可以得知它的限制圖，這對(duì)于后期的試驗(yàn)，如克隆等極其重要（分布圖可以用各種各樣的基因編輯軟件實(shí)現(xiàn)，比如DNAstar（沒(méi)用過(guò)），Geneious（在用）等。我這里再推薦一個(gè)簡(jiǎn)潔的網(wǎng)站，功能很多且看起來(lái)灰常順眼，建議收藏http://www.detaibio.com/sms2/）。
4.載體（vector）：承載裝置，功能如其名，承載外源插入序列（insert）到受體細(xì)胞的工具，我們常用的載體一般來(lái)自于質(zhì)粒和病毒。按照目的分為克隆載體和表達(dá)載體
5.轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)（具體定義在本公眾號(hào)《【現(xiàn)學(xué)現(xiàn)賣(mài)】基因及基本概念》一文中提到）：將目的DNA或者構(gòu)建好的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程，對(duì)于不進(jìn)行生理轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，常用的是CaCl2法和電擊法；還有一些載體本身是具有侵染性的病毒，那么通過(guò)感染就可將DNA導(dǎo)入寄主；與之類(lèi)似的是脂質(zhì)體，它可以與細(xì)胞膜融合從而將內(nèi)含物釋放入細(xì)胞；不得不提的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；還有顯微注射法和基因槍法。這里的分級(jí)和分類(lèi)又有點(diǎn)混亂了，以后有機(jī)會(huì)再展開(kāi)講。
三、專(zhuān)一化的載體
就像我們的螺絲刀刀頭分為一字、十字、方頭和六角一樣，每一種工具為實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩鴮?zhuān)一化。
載體類(lèi)別很多，分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)也是，按照載體本身性質(zhì)分為病毒載體和非病毒載體（質(zhì)粒，粘粒等）等；按照功能分為克隆載體和表達(dá)載體；按照受體細(xì)胞類(lèi)型分為原核載體，真核載體以及兩者均可的穿梭載體。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎貌煌妮d體，并配套使用不同的克隆技術(shù)（TA、directing、gateway等等，我發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)這部分內(nèi)容真的是難以置信的多，越寫(xiě)越多。）
1. 質(zhì)粒載體
首先想介紹的是我最近在用的這款pGEM?-T Easy克隆載體，具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)Promega官方網(wǎng)站。
（1）載體名字組成：p表示是一種質(zhì)粒（質(zhì)粒的命名：以p開(kāi)始，后面用兩個(gè)大寫(xiě)字母表示發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的研究者或者實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)比如pUC質(zhì)粒，后面的數(shù)字是指這一系列質(zhì)粒的編號(hào)），GEM是一個(gè)系列載體的名稱(chēng)（應(yīng)該是對(duì)之前存在的載體進(jìn)行改造后重命名的），T是指載體DNA5’端有游離的T（可用于PCR產(chǎn)物的直接克隆，因?yàn)橐话鉖CR產(chǎn)物3’端有A堿基，這樣目的基因與載體粘端互補(bǔ)）。
（2）物理圖譜：
（3）構(gòu)建之路：調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，提高轉(zhuǎn)化率。通常引入MCS（多克隆位點(diǎn)），或引入具有多種用途的輔助序列。比如加入lacZ’、lacⅠ基因獲得藍(lán)白斑篩選能力；加入SP6聚合酶啟動(dòng)子獲得體外轉(zhuǎn)錄能力；加真核啟動(dòng)子則變成穿梭載體等等。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果有需要也可以自己構(gòu)建載體。
pBR322（雙抗篩選）+M13mp（lacZ’乳糖操縱子與藍(lán)白斑篩選就不展開(kāi)了）→pUC18/19（藍(lán)白篩選）
pUC18/19（藍(lán)白篩選）+SP6和T7啟動(dòng)子（體外轉(zhuǎn)錄）+T堿基（增強(qiáng)連接效率）→pGEM?-T Easy（藍(lán)白篩選，體外轉(zhuǎn)錄（其產(chǎn)物可制備體外翻譯的模板，探針及反義RNA），酶切位點(diǎn)豐富（為回收克隆片段，進(jìn)行亞克隆等提供便利。））
2. 噬菌體載體
λ噬菌體載體
噬菌體：λ噬菌體是大腸桿菌中的病毒，λ-DNA是絲狀雙鏈DNA分子，48.5kb，兩端各有一個(gè)12個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘末端，稱(chēng)為cos位點(diǎn)。
載體構(gòu)建：通過(guò)對(duì)λ-DNA進(jìn)行長(zhǎng)度（48.5kb太大了，切掉了不必要的序列）和酶切識(shí)別位點(diǎn)的修飾（酶切位點(diǎn)是否成對(duì)出現(xiàn)決定了載體是插入型還是替換型），僅保留cos位點(diǎn)，左臂的頭尾基因，右臂的裂解基因和需要的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出了λ噬菌體載體。外源DNA與改造后的λ-DNA重組后，與噬菌體蛋白進(jìn)行體外包裝，可以形成感染力極強(qiáng)的載體，侵染宿主。
優(yōu)勢(shì)：與質(zhì)粒的相比，λ噬菌體載體裝載外源DNA量大，可以連接25kb的DNA，且侵染力強(qiáng)，即轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。
M13噬菌體載體
噬菌體：M13噬菌體也是大腸桿菌的病毒，其遺傳物質(zhì)是閉環(huán)正鏈ssDNA，6.4kb。
載體構(gòu)建：插入標(biāo)記基因lacZ’，多克隆位點(diǎn)，消除多余的酶切位點(diǎn)。如M13mp18載體的構(gòu)建。
用途：制備單鏈DNA，測(cè)序，定向克隆。
