最近，一只萌萌噠，滿屏原諒色的佛系“旅行青蛙”火遍朋友圈，據(jù)說(shuō)可以體驗(yàn)到養(yǎng)娃的感覺(jué)~可這只青蛙太有個(gè)性，不聲不吭就離家出走了...
?蛙??！
還有一堆實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等著看呢，
怎么還出去浪??？
小娃仔能隨心所欲的離家玩耍
是因?yàn)樵诩业臅r(shí)候奮力學(xué)習(xí)啊
作為一個(gè)學(xué)霸蛙，
不出門(mén)的時(shí)候，
在家里也會(huì)沉浸在學(xué)習(xí)思考之中：
看文獻(xiàn)、寫(xiě)論文
各位小主是不是落后了呢？
各位“麻麻們”
喂完三葉草
記得回來(lái)充電~
在組織實(shí)驗(yàn)中，
石蠟切片和冰凍切片是最常見(jiàn)的兩種切片方法
石蠟切片VS冰凍切片
石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。
冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法。制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，因而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、石蠟切片
1.?固定：
將新鮮組織切成小塊，固定于4%多聚甲醛過(guò)夜。凝固組織中的物質(zhì)成分，盡可能保持其活體時(shí)的結(jié)構(gòu)。同時(shí)能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行。
2.脫水：
為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精（無(wú)水乙醇），每次時(shí)間為1小時(shí)。固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響后期的染色效果。
3.透明：
常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在透明劑浸漬過(guò)程稱透明。?
4.浸蠟：
先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時(shí)。先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬1小時(shí)左右。
5.包埋：
以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內(nèi)上，然后置于速凍臺(tái)，讓石蠟固定。
6.切片：
切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可將蠟塊至于冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為3-5um，用毛筆輕托輕放在37度水浴中展片。
7.貼片與烤片：
一般使用恒溫水浴鍋，溫度控制在37-40℃左右，有利于石蠟切片的展開(kāi)，貼好的切片置于60℃恒溫箱內(nèi)干燥2小時(shí)，蛋白質(zhì)凝固后即可染色。
8.切片脫蠟及水化：
干燥后的切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，然后依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進(jìn)行經(jīng)純酒精、95%、85%、70%進(jìn)行水化。
9.染色：
經(jīng)典的蘇木精和伊紅：細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。
免疫組化：指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)。
二、冰凍切片
1.取材：
應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。
2.速凍：
1）將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）。
2）如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)。?
3）當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。
4）在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。
5）若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>
3.固定：
1）樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。
2）取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。
3）組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。
4.切片：
1）恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm。
2）切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃ ~?-20℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。
5.免疫熒光染色：
1）冰凍切片室溫晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時(shí)（此步可不洗）。?
2）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸）。
3）將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜。
4）第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。
5）滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1小時(shí)?；厥斩?，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗5min×3次。
6）滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。
7）回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
8）做好的切片放在切片盒內(nèi)，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
1.切片上卷且不能形成連續(xù)蠟帶
原因：①切片刀不夠鋒利。②切片刀與蠟快的角度不當(dāng)。③蠟塊四周留蠟邊太少。④石蠟硬度過(guò)大，黏度不夠。
解決方法：①重新磨刀。②調(diào)整切片刀的角度。③可重新包埋或?qū)⑾瀴K四周熔化，再放入包埋框中補(bǔ)蠟，修理蠟塊時(shí)組織塊周圍保留的石蠟以2mm左右為宜。④蠟塊過(guò)硬可適當(dāng)加些蜂蠟，或更換熔點(diǎn)較低的石蠟重新包埋。
2.切片彎曲且不能形成直帶
原因：①蠟塊上下或左右兩邊不平行。②蠟塊與切片刀刀口不平行。③組織塊外形不整齊。④切片刀各處的鋒利程度不一致。
解決方法：①將蠟塊四邊反復(fù)修平對(duì)稱。②調(diào)節(jié)蠟塊夾持器，使其與切片刀平行。③修整組織塊時(shí)，注意修切整齊。④移動(dòng)切片刀，更換刀口位置。
3.切片上出現(xiàn)裂紋
原因：①切片刀上有小缺口，或刀口不平整。②組織中可能含有較硬之物質(zhì)，如固定液之結(jié)晶石灰質(zhì)。③包埋時(shí)石蠟凍結(jié)太慢。
解決方法：①切片刀某處有缺口，可調(diào)換刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口過(guò)多且不平整，可先將刀鋒垂直在磨刀石上輕輕磨數(shù)次，然后按常規(guī)磨刀田。②組織中硬性物質(zhì)太多，則不宜用。③糾正包埋時(shí)的缺點(diǎn)。一般待蠟塊周圍凝結(jié)一層，即可放入冷水中。
4.切片粘在切片刀不易取下
原因：切片時(shí)有靜電作用，產(chǎn)生靜電吸引，在冬季或氣候干燥時(shí)常出現(xiàn)這種情況。
解決方法：可用加濕器。以增加空氣中的水分，而減少靜電作用。?
5.切片厚薄不均
原因：①切片微動(dòng)部分失靈，齒輪跳格。②蠟塊太大，過(guò)硬，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)刀刃受震動(dòng)。
解決方法：①修理切片機(jī)失靈的部分，調(diào)整螺旋。加機(jī)油潤(rùn)滑零件，必要時(shí)需請(qǐng)專業(yè)技術(shù)人員調(diào)整切片機(jī)。②如蠟塊過(guò)大，以后取材時(shí)注意取材的大小。蠟塊組織過(guò)硬，可返回水中浸泡，再重新脫水和包埋。
6.切片碎爛或組織脫出并與石蠟分離
原因：①組織脫水，透明不夠。②浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)．浸蠟溫度過(guò)高。③組織脫出是由于脫水、透明時(shí)間不夠，或組織中含有乙醇等，石蠟不易滲入組織中．故導(dǎo)致石蠟與組織分離。④二甲苯使用時(shí)間過(guò)久。
解決方法：①必須按組織大小厚薄選擇脫水、透明時(shí)間。②依組織的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)確定浸蠟時(shí)間．控制包埋溫度。一般這種情況難以補(bǔ)救。③脫水，透明滲蠟不夠，應(yīng)重新熔化，退回入二甲苯和酒精，再進(jìn)行滲蠟包埋。④更換二甲苯。
7.切片皺褶太多且不能完全展開(kāi)
原因：①石蠟太軟或室溫過(guò)高。②切片刀上粘有殘余的石蠟，刀口不干凈。③組織浸蠟時(shí)間不夠．或脫水、透明不夠。④切片刀不鋒利。
解決方法：①可將蠟塊放入冰箱中冰凍后切片。并在切片時(shí)一邊切片一邊用冰塊冰凍或換蠟。如室溫過(guò)高，可開(kāi)空調(diào)降低室溫。②切片刀不干凈，可用棉花沾少許二甲苯將刀口拭干凈。③組織浸蠟不夠，可重復(fù)浸蠟過(guò)程。④將切片刀磨銳利再行切片。
