電泳
電泳速度與DNA構(gòu)象的關(guān)系
質(zhì)粒DNA通常具有三種不同的構(gòu)象：共價(jià)閉合環(huán)狀（超螺旋）、線(xiàn)型、開(kāi)環(huán)型（環(huán)狀）.瓊脂糖凝膠電泳時(shí),一般共價(jià)閉合環(huán)狀的遷移速度最快,其次為線(xiàn)狀分子,開(kāi)環(huán)型分子最慢。
核酸分子大小與瓊脂糖濃度范圍的對(duì)應(yīng)關(guān)系
分子量大的核酸電泳時(shí)使用濃度較小的凝膠，分子量小的核酸電泳時(shí)使用濃度較大的凝膠。核酸在濃度越大的凝膠中電泳速度越小。如果膠濃度偏高，可能跑不動(dòng)，如果膠濃度偏低，可能跑得太快，分不開(kāi)。
凝膠濃度（%） 線(xiàn)性DNA長(zhǎng)度（bp）
0.5 1000～30000? 0.7 800～12000? 1.0 500～10000?
1.2 400～7000? 1.5 200～3000? 2.0 50～2000
注意：核酸染料有毒，具有致癌性，注意保護(hù)自己。
電壓關(guān)系
電壓過(guò)高會(huì)因?yàn)榘l(fā)熱導(dǎo)致膠融化，跑太長(zhǎng)時(shí)間marker會(huì)跑出去，甚至污染電解液。電壓看電泳槽多大，兩電極之間的距離，每cm 3~5V。例如一個(gè)20cm的電泳槽，電壓就應(yīng)該設(shè)為60~100V間。電壓大，速度就快。
拖尾
marker拖尾是因?yàn)榫彌_液要換了或者緩沖液太少了沒(méi)有蓋住膠。
菌落PCR
1. 設(shè)計(jì)引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克?。ㄈ鐔蚊盖谢蚱侥┒诉B接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯(cuò)誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時(shí)挑取的菌體不宜太多，否則會(huì)有非特異性擴(kuò)增。
2. 使用的引物濃度不能太高，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)數(shù)也不能太多，一般不超過(guò)25個(gè)。同時(shí)因?yàn)閿U(kuò)增的片段的GC含量問(wèn)題，有的GC含量很低，有的又很高，導(dǎo)致菌落PCR不容易擴(kuò)增出目的條帶，在此建議在設(shè)置PCR程序時(shí)以高GC的溫度為上限，每一循環(huán)降0.2度左右。
退火溫度是當(dāng)50%的引物和模板表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。 DNA聚合酶在60-72度活性比較高。因此，退火溫度是可以高于60度的。延伸的溫度不要低于退火溫度，一般72℃。
