感謝小學(xué)學(xué)！
測序原理：
將基因打斷成片段reads；每段reads一端連接不同的UMI做為標(biāo)識；PCR；測序
uniquely mapped reads：reads的唯一性由UMI和map位置共同確定
PCR duplicates：pcr后，UMI相同且map位置相同的reads會擴增很多條，去duplicates就是，僅保留一條，去除由于PCR效率不同導(dǎo)致的差別
基因表達量=sum（去除duplicates后的uniquely mapped reads）
expression A = read1 +?read2 +read3
expression B = reada +?readb +readc +readd +reade
影響分析的因素：
文庫大小的影響：文庫越大，細(xì)胞越多，含有的geneA絕對值就越多
基因長度影響：基因越長，打斷后的reads就越多，相加值就越大
測序深度影響：相當(dāng)于PCR效率不同帶來的影響
為什么要PCR：對于chipseq、singlecellseq、atacseq細(xì)胞量少，測序時信號非常低，無法檢測到，送測前PCR是為了擴大信號。
去duplicates是去除PCR的影響，效果相當(dāng)于收獲樣本打成片段后直接測序。
去除文庫大小影響，就是去除不同批次收樣細(xì)胞量不同的影響，效果相當(dāng)于每次都收獲相同量的細(xì)胞進行測序
常規(guī)RNAseq數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化步驟：
counts矩陣，行為sample，列為gene
方法1：
exprSet=mean(colSums(exprSet))*exprSet/colSums(exprSet)
exprSet=log2(exprSet+1)
方法2：TMM（edgr+limma包）
注意：（1）方法1結(jié)果全為正，方法2會出現(xiàn)負(fù)值；（2）方法1中，當(dāng)不同批次送樣，或同批次但不同lane（沒有混樣）時需要消除批次效應(yīng)（具體步驟上網(wǎng)找。方法2包含了去批次處理，不需再去批次。
