泛素和泛素化介紹
泛素
泛素為含76個(gè)氨基酸、大小約為8.6 kDa的小蛋白質(zhì)，在真核生物中普遍存在且高度保守。人類基因組中的四個(gè)基因編碼泛素：UBB，UBC，UBA52和RPS27A。
泛素氨基酸序列：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG
泛素具有7個(gè)賴氨酸殘基（K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63）和一個(gè)甲硫氨酸殘基（M1）。泛素之間主要通過賴氨酸殘基和甲硫氨酸殘基進(jìn)行各種連接。由此產(chǎn)生的泛素鏈產(chǎn)生一定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可通過對蛋白底物進(jìn)行修飾并決定底物的功能。
泛素化
將泛素添加到底物蛋白質(zhì)中稱為蛋白質(zhì)的泛素化。蛋白質(zhì)泛素化是一種動(dòng)態(tài)的多方面翻譯后修飾，涉及真核生物學(xué)的幾乎所有方面。泛素化涉及三個(gè)主要步驟：活化，結(jié)合和連接，分別由泛素激活酶（E1），泛素結(jié)合酶（E2s）和泛素連接酶（E3s）執(zhí)行。其中人源E1有2種：UBA1和UBA6；人源E2有35種；人源E3有數(shù)百種。
泛素化與去泛素化步驟
- 通過E1泛素激活酶激活泛素與ATP
- E2泛素結(jié)合酶的半胱氨酸活性位點(diǎn)與被E1泛素激活酶轉(zhuǎn)移的泛素形成硫酯鍵
- E3泛素連接酶通過在泛素的Gly76的羧基與底物中的Lys的ε-胺之間形成異肽鍵而參與底物的泛素化
- 去泛素化酶（DUB）從底物中除去泛素并將泛素再循環(huán)到胞質(zhì)池中
E3酶具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之一：HECT結(jié)構(gòu)域以及RING結(jié)構(gòu)域。HECT結(jié)構(gòu)域的E3連接酶先自身結(jié)合泛素然后將泛素轉(zhuǎn)移至底物，而RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶使E2酶直接將泛素轉(zhuǎn)移至底物。
HECT結(jié)構(gòu)域E3通過2種機(jī)制連接遍在蛋白質(zhì)靶底物：首先，遍在蛋白從E2的活性位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到E3的活性位點(diǎn)中的Cys，然后遍在蛋白化目標(biāo)底物中的Lys殘基。相反，RING-和RING相關(guān)的結(jié)構(gòu)域E3連接酶在一步中用作泛素化靶基質(zhì)的支架：E2將遍在蛋白直接轉(zhuǎn)移至靶底物中的Lys殘基。
目前，人體內(nèi)還存在E4酶。E4酶為泛素鏈延伸因子，能夠?qū)畏核鼗牡孜镞M(jìn)行泛素鏈的延伸形成多聚泛素化。
泛素化種類
單泛素化是在一個(gè)底物蛋白殘基上添加一個(gè)泛素分子。 多單泛素化是將一個(gè)泛素分子添加到多個(gè)底物殘基中。多泛素化是在底物蛋白上的單個(gè)殘基上形成遍在蛋白鏈。目前，泛素可結(jié)合的底物殘基有賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸
根據(jù)泛素與底物的連接位點(diǎn)，目前有9種方式的泛素化，包括M1, K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63, G76。不同方式的泛素化調(diào)控不同的功能。其中，與蛋白酶體降解相關(guān)的泛素化為K48。
全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究確定了成千上萬種蛋白質(zhì)上成千上萬的泛素化位點(diǎn)。大多數(shù)蛋白質(zhì)在其細(xì)胞壽命的某些時(shí)刻將經(jīng)歷泛素化。
蛋白質(zhì)泛素-蛋白酶體降解研究思路
研究蛋白質(zhì)泛素-蛋白酶體降解大部分是研究兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，即一個(gè)E3連接酶和一個(gè)底物蛋白。
底物蛋白的降解
CHX和MG132處理檢測底物蛋白的降解
環(huán)己酰亞胺（Cycloheximide, CHX）為細(xì)胞內(nèi)蛋白合成抑制劑。MG132為蛋白酶體抑制劑。
圖3中，相對于MG132未處理組中SUBSTRATE蛋白在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化，MG132處理組中的SUBSTRATE蛋白在2h、4h、8h的水平明顯減小。說明SUBSTRATE的降解與蛋白酶體相關(guān)。
E3泛素連接酶能夠促進(jìn)底物蛋白的降解
圖4中，隨著E3泛素連接酶表達(dá)量的增加，底物蛋白的表達(dá)水平相應(yīng)降低。圖5中，隨著E3泛素連接酶酶活性失活突變表達(dá)量的增加，底物蛋白的表達(dá)水平無明顯變化。圖6中，用E3泛素連接酶的siRNA敲低細(xì)胞內(nèi)E3泛素連接酶的表達(dá)水平，底物蛋白的表達(dá)水平相應(yīng)增加。圖7中，過表達(dá)E3泛素連接酶酶，底物蛋白的半衰期減少。圖8中，敲低E3泛素連接酶酶，底物蛋白的半衰期增加。說明E3泛素連接酶能降低底物蛋白的表達(dá)水平。
E3泛素連接酶和底物蛋白的相互作用
E3泛素連接酶和底物蛋白in vitro and in vivo的相互作用
使用免疫共沉淀的方法檢測兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。大致分為以下三種：
- 兩個(gè)蛋白均為過表達(dá)，見圖9和圖10。
- 一個(gè)蛋白為過表達(dá)，另一個(gè)為內(nèi)源蛋白質(zhì)，見圖11和圖12。
- 兩個(gè)蛋白均為內(nèi)源蛋白質(zhì)，見圖13和圖14。
E3泛素連接酶和底物蛋白不同結(jié)構(gòu)域的相互作用
通過文獻(xiàn)或者生物信息學(xué)分析E3泛素連接酶和底物蛋白不同的結(jié)構(gòu)域。圖15上為E3泛素連接酶的不同結(jié)構(gòu)域示意圖：Domain1, Domain2, Domain3, Domain4；圖15下為底物蛋白的不同結(jié)構(gòu)域示意圖：DomainA, DomainB, DomainC, DomainD。使用免疫共沉淀的方法檢測兩個(gè)蛋白質(zhì)之間不同結(jié)構(gòu)域的相互作用，見圖16和圖17。找到相應(yīng)結(jié)構(gòu)域后，檢測這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，見圖18和圖19。
E3泛素連接酶泛素化底物蛋白
底物蛋白能被泛素化
一般使用外源表達(dá)的泛素分子檢測蛋白質(zhì)的泛素化，也可使用內(nèi)源的泛素抗體。因?yàn)榉核鼗癁榉核胤肿优c底物蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，SDS無法破壞此種相互作用力，所以圖20中能夠看到多聚泛素化鏈的存在。一個(gè)泛素分子大約為8.5KD，因此IB結(jié)果可能會出現(xiàn)基于底物蛋白質(zhì)清晰的ladder帶或smear帶。
底物蛋白能被K48鏈泛素化
蛋白質(zhì)泛素化為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，能夠調(diào)控蛋白質(zhì)的功能。目前的泛素化種類有K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63，即泛素分子的K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63與底物蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。一般認(rèn)為，K48的泛素化可被蛋白酶體識別。因此，需要確認(rèn)底物蛋白質(zhì)的泛素鏈為K48鏈。將泛素分子賴氨酸單位點(diǎn)突變（見圖21）或泛素分子單賴氨酸保留突變（見圖23），通過免疫沉淀和免疫印跡的方法檢測底物蛋白質(zhì)泛素化的種類，見圖22和圖24。
E3泛素連接酶能泛素化底物蛋白
通過過表達(dá)（圖25）或敲低（圖26）E3泛素連接酶的方式檢測底物蛋白質(zhì)泛素化水平的改變。
體外泛素化實(shí)驗(yàn)
體外泛素化能夠排除體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，讓E3泛素連接酶直接與底物蛋白質(zhì)作用，使E3泛素連接酶泛素化底物蛋白質(zhì)更有說服力。體外UB, E1, E2, ATP以及buffer均有商業(yè)化試劑盒。只需純化E3泛素連接酶和底物蛋白質(zhì)進(jìn)行體外泛素反應(yīng)，檢測底物蛋白質(zhì)的泛素化。
