一、何為 SSR ?

SSR ( simple sequence repeats ) 即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，也稱為微衛(wèi)星 DNA(microsatellite DNA )，在真核生物基因組中廣泛存在，一般是以1-bp 組成較低程度的重復(fù)序列，主要以2-3個(gè)核酸為重復(fù)單位如(GA)n、(AC)n 和(GAA)n 等。

從進(jìn)化角度看物種間重復(fù)序列的差異是自然選擇的結(jié)果。因此鑒定SSR在基因組分析中有重要意義。微衛(wèi)星在原核生物和真核生物基因組中隨機(jī)分布，而且該標(biāo)記呈共顯性，符合孟德爾遺傳模式，易于操作，具有高度重復(fù)性和可靠性，顯示出較強(qiáng)的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，使其在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測(cè)、基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇等領(lǐng)域有重要應(yīng)用

SSR 通?？梢苑譃榛蚪M SSR 和 EST-SSR 兩大類。GenomicSSR 是基于基因組序列開發(fā)的，開發(fā)起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且因?yàn)樘结樀木壒?，種類比較局限，EST-SSR是指存在于表達(dá)的基因序列內(nèi)的SSR，不包括存在于內(nèi)含子及非表達(dá)的調(diào)控區(qū)等之中的SSR，通常三個(gè)堿基重復(fù)的占多數(shù)，與不引起基因翻譯過程中移碼現(xiàn)象的發(fā)生相一致，EST-SSR有更強(qiáng)的種屬轉(zhuǎn)移性。不過一般EST-SSR的重復(fù)序列要短于基因組中的SSR，而且從EST中篩選的微衛(wèi)星要比從基因組中篩選的微衛(wèi)星多態(tài)性低。

二、使用 Misa 結(jié)合 Primer3 來批量設(shè)計(jì) SSR 引物

MISA，英文全稱為Micro Satellite identification tool，即微衛(wèi)星識(shí)別工具。
MISA是使用 perl 編寫的一支程序，能識(shí)別出序列中的微衛(wèi)星和復(fù)合微衛(wèi)星（兩個(gè)微衛(wèi)星之間由由不多于100bp的堿基對(duì)隔開），并給出其所在位點(diǎn)。

MISA下載網(wǎng)址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html

1. MISA 用法：

misa.pl filename

其中，fastfile是序列文件，同時(shí)在運(yùn)行程序的工作目錄下必須有一個(gè)名稱為“misa.ini”
的文件。該文件內(nèi)容為：

definition(unit_size,min_repeats): 1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs): 100 

該文件指定了misa的參數(shù)，即1個(gè)堿基重復(fù)10次及10次以上；2個(gè)堿基重復(fù)6次及6 次以上；
3個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上；4個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上；5個(gè)堿基重復(fù)5 次及5次以上；6堿
基重復(fù)5次及5次以上，這樣的堿基重復(fù)序列才算是微衛(wèi)星序列。 同時(shí)，兩個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100bp的時(shí)候，兩個(gè)微衛(wèi)星組成一個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。

MISA的輸出結(jié)果：

MISA會(huì)在 fastafile 所在的文件夾下生成兩個(gè)文件，分別是 “.misa” 和 “.statistics”

• .misa：以表格的形式列出微衛(wèi)星的類型和位點(diǎn)；
• .statistics ：統(tǒng)計(jì)微衛(wèi)星的類型和頻數(shù)。

在MISA的下載頁(yè)面中，提供了3個(gè)附加的 perl 腳本，分別是：Get_est_trimmer.pl，p3_in.pl 和 p3_out.pl。

由于 MISA 程序讀取 fasta 文件中的序列 ID，將序列 ID 中的空格用下劃線 ”_” 填補(bǔ)了，所以在fasta文件中，其序列ID最好不要有空格。否則運(yùn)行接下來的程序時(shí)，會(huì)出問題。

Get_est_trimmer.pl
針對(duì)EST序列，可以除去EST序列中短的序列和兩端不明確的堿基。

2.第二步：

p3_in.pl 輸入 misa.pl 的輸出結(jié)果，將引物設(shè)計(jì)的參數(shù)文件（模板，產(chǎn)物長(zhǎng)度，目標(biāo)區(qū)域等）導(dǎo)入到一個(gè)以“p3in”為后綴的文件中。

p3_in.pl filename.misa

3.第三步：

primer3主設(shè)計(jì)引物腳本

primer3_core -default_version=1 -output=filename.p3out filename.p3in

4.第四步：

p3_out.pl對(duì)primer3產(chǎn)生的文件進(jìn)行提取合，得到最后的結(jié)果文件 filename.result

p3_out.pl filename.p3out filename.misa

tips： p3_in.pl 和 p3_out.pl 這兩個(gè)程序可能需要修改才能正常使用。

參考：http://www.chenlianfu.com/?p=255

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