由于實驗室沒有服務(wù)器，我只有一臺iMac，跟之前學(xué)的時候已經(jīng)有完善的服務(wù)器系統(tǒng)完全不一樣，我需要在iMac上搭建環(huán)境用于分析數(shù)據(jù)。

0. 準(zhǔn)備工作

16 G內(nèi)存，1 TB硬盤，有terminal

第一部分 搭建環(huán)境

1.1 下載軟件，構(gòu)建環(huán)境變量

什么是環(huán)境變量？就是一個環(huán)境，里面有你想要的東西，不知道大家有沒有遇到過快捷鍵沖突的，這就意味著很多軟件的快捷鍵或者用法是一樣的，如果同時啟用很多軟件可能會沖突。

下載軟件只是下載，還需要安裝，安裝成功之后還需要打開才能使用，創(chuàng)建一個環(huán)境變量（相當(dāng)于創(chuàng)建一個房間），將軟件安裝在該環(huán)境變量下之后（將軟件都拖到一個房間），只要激活這個環(huán)境變量（打開這個房間的門），那么下面的軟件就全部激活了，不需要一個一個的再打開。

# 創(chuàng)建新的文件夾
mkdir biosoft
cd biosoft
# 和Linux不同，Linux用的是wget來下載，而iMac用的是curl -O
curl -O https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
bash Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
yes
# 激活miniconda之后，構(gòu)建新的環(huán)境變量
conda create -n rna python=2 
y  # 回答 yes
conda info --envs # 查看當(dāng)前環(huán)境變量
source activate rna  # 激活環(huán)境變量

1.2 安裝相應(yīng)軟件

先讀文獻調(diào)研，得到轉(zhuǎn)錄組分析需要用到的軟件列表；

• 質(zhì)控
• <u>fastqc , multiqc</u>, trimmomatic, cutadapt ,<u>trim-galore</u>
• 比對
• star, <u>hisat2, bowtie2</u>, tophat, bwa, subread 我的電腦內(nèi)存不夠，star跑不起來
• 計數(shù)
• htseq, bedtools, deeptools, salmon, featureCount

如果你對一個軟件不了解的話，那么安裝之前在https://bioconda.github.io/recipes.html，檢索該軟件包是否存在，或者使用conda search packagename進行檢索。

conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free 

conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge 

conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda conda config --set show_channel_urls yes

# 速度還挺快的，大約不到半分鐘能安裝一個軟件
conda install -y fastqc 
conda install -y sra-tools 
conda install -y trimmomatic 
conda install -y cutadapt multiqc 
conda install -y trim-galore 
conda install -y star hisat2 bowtie2 
conda install -y subread tophat htseq bedtools deeptools 
conda install -y salmon source deactivate #注銷當(dāng)前的rna環(huán)境 
conda install -y featurecounts hisat2  ## 查看表達(dá)量的話，這兩個是足夠了的 featurecounts 可能是subred 下面的，所以我單獨去下載是沒有的
conda install -y bowtie2

有點丑，改一改界面字體的顏色

cd ~
vim ~/.bash_profile # 在后面添加上代碼如下
PS1="\[\e[32;1m\]\u \[\e[33;1m\]\t \[\e[35;1m\]\w \n\[\e[0;40m\]$" 

bash ~/.bash_profile # 退出后激活環(huán)境變量
# 醬紫顏色就會變得漂漂亮亮的啦～

1.3 下載參考基因組

請注意參考基因組+注釋的下載需要在同一個平臺，推薦順序 ensemble> UCSC，NCBI.

一般來說，需要下載相應(yīng)的參考基因組，然后構(gòu)建索引index，而且每一種比對軟件都需要自己的索引（也可以去軟件相應(yīng)的網(wǎng)站上下載）。

因為界面太丑了，希望用tree功能去查看文件夾架構(gòu)，所以我們安裝一個tree功能

# 將相應(yīng)命令寫入bash文件里面，然后激活
vim ~/.bash_profile
# 在后面加入以下代碼
alias tree="find . -print | sed -e 's;1*/;|____;g;s;____|; |;g'"
# bash
bash ~/.bash_profile
# 妥妥的

正式開始下載！

human-不要下載top level哦

教訓(xùn)：坑隊友系列：ftp協(xié)議下載ensembl參考基因組

## genome
curl -O ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa.gz
## 再說一遍，不要下載top-level?。?！以上這個代碼千萬不要運行！

curl -O ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna_sm.primary_assembly.fa.gz

# 或者 
cp  /Volumes/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz ./
## gtf 注釋文件下載
curl -O ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-95/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.95.gtf.gz

1.4 構(gòu)建索引

索引是什么東西？我們?nèi)D書館查找書籍，都會按照圖書背后的編碼去查找吧！或按照圖書分類法，或者按照首字母大寫等等，這些查找書籍的方法，就叫做索引，有了索引就可以快速的找到我們想要的書。那么對于參考基因組的比對來說，也是醬紫的！我們拿到一個reads，想知道它是在基因組上的那個位置，不可能一條一條的比對吧？當(dāng)然是有偷懶的辦法啦，那就是用索引index。

## hisat 2      -p 4 是設(shè)置4個線程的意思
hisat2-build -p 4 /Users/bioinformatic/reference/hg38/hg38.fa /Users/bioinformatic/reference/hg38/hg38.ht2 

## bowtie2      --threats 4 是設(shè)置4個線程的意思
bowtie2-build --threads 4 /Users/bioinformatic/reference/hg38/hg38.fa /Users/bioinformatic/reference/hg38/hg38 &

總結(jié)

要學(xué)會這部分內(nèi)容，至少需要掌握以下基本知識：
（1）你需要了解轉(zhuǎn)錄組的基本原理：推薦“陳巍學(xué)基因”，Statquest，還有Illumia的官方視頻，三個視頻加起來不超過1個小時，需要認(rèn)真體會學(xué)習(xí)；
（2）還需要會簡單的linux操作，比如cd，mkdir等最基本的命令的理解和使用；
（3）基本的去可視化思維和linux操作，比如linux下載和安裝軟件的思維和基本操作。
（4）理解所用到的文件的基本含義；
（5）待補充。
簡而言之，你遇到的每一個疑惑的地方，都是一個新的知識點。萬事開頭難，加油吧！

在這里感謝生信技能樹的教程分享，感謝Jimmy老師給我的無私幫助；感謝豆豆和花花給我的指導(dǎo)和幫助，尤其給了我非常多的基礎(chǔ)知識方面的輔導(dǎo)，不厭其煩的解答我非常幼稚的問題；謝謝洲更在我項目實操過程中給予了強有力的支持。