原理概述：
RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，滅活RNA酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來時不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，可通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、完整的總RNA。
真核細(xì)胞中含有多種RNA，如rRNA、mRNA、tRNA及一些小分子RNA。RNA以rRNA的數(shù)量最多，占80%-85%，tRNA及核內(nèi)小分子 RNA10%-15%，而mRNA分子占1%-5%。

核酸提取原則：
⑴ 保證核酸的完整性；
⑵ 獲得高純度的核酸；
⑶ 操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)。

圖片來自TIANGEN-mRNA.png

一、利用TRNzol Universal總RNA提取試劑

TRNzol Universal 是在TRNzol 基礎(chǔ)上研發(fā)的含有指示劑的總RNA 提取試劑。該產(chǎn)品具有更強(qiáng)的裂解能力，更高的靈敏度，可從病毒、細(xì)菌、真菌、動物和植物細(xì)胞、組織、體液等樣本中提取總RNA 的試劑。TRNzol Universal 能夠充分裂解樣本、溶解細(xì)胞內(nèi)含物，并有效抑制RNase 活性，提取樣本中的總RNA，同時保證了提取過程中RNA 的完整性。該試劑對樣本起始量無限制，一個小時內(nèi)即可完成反應(yīng)。

TRNzol Universal試劑.jpg

1. 自備試劑
   氯仿、異丙醇、無菌水、75%乙醇（用無菌水配制）

2. Prepare
   1.5ml離心管、計(jì)時器、液氮、研缽、鑷子、渦旋振蕩器、低溫離心機(jī)、超微量分光光度計(jì)

3. 注意事項(xiàng)：
   

   
   
   圖片來自TIANGEN官網(wǎng).png

4. Steps

⑴ 取0.1g新鮮菌絲于液氮中快速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌冷凍離心管中；
⑵ 渦旋混勻，室溫靜置5min；
⑶ 加入200μl氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置3min；
⑷ 4℃ 12,000rpm離心15 min。樣品會分成三層：粉色的有機(jī)相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相約500 μl轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中；

離心后出現(xiàn)分層.jpg

⑸ 在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10 min；
⑹ 4℃ 12,000 rpm離心10 min，去上清。離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀；
⑺ 加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀；
⑻ 4℃ 10,000 rpm 離心2min，倒出液體，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出；
⑼ 室溫放置3min晾干沉淀；
⑽ 加入30-50μl RNase-Free ddH₂O，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA（冰上進(jìn)行）。

Min point ：
異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，使得RNase失活；同時使得核酸蛋白復(fù)合物分離，將RNA釋放到溶液中；
酸性酚-氯仿抽提，低pH值的酚使RNA進(jìn)入水相，蛋白和DNA留在有機(jī)相
苯酚和脂類溶于有機(jī)溶劑氯仿中形成有機(jī)相；由于氯仿密度較大，使得有機(jī)相位于下層，而水相在上層
異丙醇：沉淀RNA
乙醇：沉淀RNA、除小分子、清除多余的有機(jī)溶劑
測定OD₂₆₀/₂₈₀=1.9~2.1

圖片來自TIANGEN官網(wǎng).png

RNA溶于上層的水相.png

Total RNA.png