之前我們介紹了序列比對的常用工具：BLAST，但是其運行速度慢的令人捉急。

當我們遇到問題，要么解決問題，要么解決導(dǎo)致問題產(chǎn)生的人。如果不是給導(dǎo)師打工，怎么會出現(xiàn)這種問題（手動狗頭）。但是解決老板的難度有點大（畢竟解決掉之后就沒人給發(fā)錢了），所以我們只能退而求其次，嘗試解決一下問題。

為了效率，為了不辜負這本就不多的讀研補貼，于是我們找到了BLAT 和DIAMOND~

唯快不破

DIAMOND

DIAMOND作為一個和BLAST具有相似功能的軟件，具有以下特點：

• 比BLAST快500到20,000倍
• 長序列的移框聯(lián)配分析(frameshift alignment)
• 資源消耗小，普通臺式機和筆記本都能運行
• 輸出格式多樣
  對于科研工作者來說，時間就是生命，看到速度這么快，其他的優(yōu)點都可以四舍五入忽略不計了。軟件的安裝很簡單，以下是具體命令：

wget http://github.com/bbuchfink/diamond/releases/download/v0.9.25/diamond-linux64.tar.gz
tar -zxzf diamond-linux64.tar.gz

DIAMOND的功能是將蛋白序列或者其翻譯后的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，與blast相比功能單一，但也讓它的使用格外的簡單。

不推薦將核苷酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，因為可能有許多序列是比對到非編碼序列上的，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，將導(dǎo)致假陰性過高。

下載nr數(shù)據(jù)庫并建庫

具體命令如下：

wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gz
gunzip nr.gz

diamond makedb --in nr --db nr

• --in: 后面跟蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫
• --db： 指定生成的diamond數(shù)據(jù)庫名稱

比對搜索

相當簡單，只有兩個子命令，blastx和blastp，前者比對DNA序列，后者比對蛋白

diamond blastx --db nr -q reads.fna -o dna_matches_fmt6.txt
diamond blastp --db nr -q reads.faa -o protein_matches_fmt6.txt

參數(shù)簡單介紹：

• -q: 輸入的待檢索序列
• -o：指定輸出文件，默認以 --outfmt 6 格式進行輸出
• --db: 后面跟著我們建立好的diamond 蛋白數(shù)據(jù)庫

BLAT

Blat，全稱 The BLAST-Like Alignment Tool，可以稱為"類BLAST 比對工具"，對于DNA序列，BLAT是用來設(shè)計尋找95%及以上相似至少40個堿基的序列。對于蛋白序列，BLAT是用來設(shè)計尋找80%及以上相似至少20個氨基酸的序列。

Blat 的主要特點就是：速度快，共線性輸出結(jié)果簡單易讀。

對于比較小的序列（如 cDNA 等）對大基因組的blat與blast比較比對，blat 無疑是首選。Blat 把相關(guān)的呈共線性的比對結(jié)果連接成為更大的 比對結(jié)果，從中也可以很容易的找到 exons 和 introns。因此，在相近物種的基因同源性分析和EST 分析中，blat 得到了廣泛的應(yīng)用。

Blat的比對速度之所以能比Blast快幾百倍,是因為此兩者之間的比對機制有著本質(zhì)的差別。Blast是將查詢序列索引化，然后線性搜索龐大的目標數(shù)據(jù)庫，期間頻繁地訪問硬盤數(shù)據(jù)，時間和空間上的數(shù)據(jù)相關(guān)性較??；

Blat則將龐大的目標數(shù)據(jù)庫索引化，然后線性搜索查詢序列，這種搜索方式在時間和空間上的數(shù)據(jù)相關(guān)性比較大。Blat將數(shù)據(jù)庫索引一次性讀入內(nèi)存，可以反復(fù)地高速調(diào)用，無需訪問硬盤，占用的系統(tǒng)資源很少。只要索引建立，查詢序列的量越大，Blat的優(yōu)勢就越明顯。

基本原理

首先blat將參考序列拆分成tiles/kmers，其拆分的方式取決于兩個參數(shù)：

• -tileSize and -stepSize 。其中 -tileSize決定tiles/kmers的大小，一般設(shè)定范圍是：8-12，預(yù)設(shè)DNA為11，蛋白質(zhì)為5
• -stepSize 決定tiles/kmers移動的步長。

BLAT

軟件下載與安裝

簡單方便，只需無腦輸入以下命令：

wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/blat/blat
chmod u+x blat

軟件運行（比對）

命令如下：

blat nt test.fa test.out -out=blast8

blat有很多參數(shù)可以選擇，但大部分時候我們按照默認的即可。

blat的輸入文件和待查詢數(shù)據(jù)庫的格式，可以是fa/nib/2bit三種格式中的任意一種。運行時十分簡單，不需要進行建庫就可以直接比對。

軟件運行時，依次輸入軟件名（軟件執(zhí)行路徑），待比對的數(shù)據(jù)庫，待搜索的序列，輸出結(jié)果。順序前后不能顛倒。這樣就可以開始比對了

程序開始運行后，會在讀完database 中的所有subject 序列時在屏幕輸出database的統(tǒng)計結(jié)果。
以下是一些常用的參數(shù)：

• -noHead: 不輸出表頭信息，有助于結(jié)果文件的后續(xù)處理
• -out： 指定輸出的文件格式，此處使用的是blast的m8格式
• -t： 指定數(shù)據(jù)庫的類型，dna/prot/dnax
• -q: 指定序列類型，dna/rna/prot/dnax/rna

內(nèi)存溢出

值得關(guān)注的是，因為blat的算法原理，它是將整個帶查詢數(shù)據(jù)庫全部讀入內(nèi)存進行比對。因此如果你的服務(wù)器內(nèi)存不大，不建議使用blat進行nt/nr庫的比對。

下面給出一個簡單的計算方法，用于評估自己的服務(wù)器是否可以順溜的run blat。對于帶查詢基因組，平均每個堿基，需要2bytes的內(nèi)存。wiki給出的人類基因組大小為3100Mb，因此我們大概需要6.2G的內(nèi)存才可以順利的對人類基因組進行blat查詢。

年少無知的我，用128G內(nèi)存的服務(wù)器跑nt數(shù)據(jù)庫，理所當然的把我們課題組的服務(wù)器跑崩了~