按照字母排序，誰排在后面誰是分子，排在前面為分母

GEO芯片分析中的大坑，差異基因完全相反！

GEO的芯片分析，可以看一下這一篇。
最有誠意的GEO數(shù)據(jù)庫教程

GEO的芯片分析，一到了差異分析部分，幾乎沒有懸念，因為其中的步驟都是limma包的作者定義的，我們沒有修改的空間，這里面常見的坑就是，

差異分析的結(jié)果會完全相反，原本高表達(dá)的會變成低表達(dá)。

不懂內(nèi)在邏輯的時候，想要正確完全靠的是運(yùn)氣，主要看兩組的命名，比如，一個3vs3的實驗，我們的分組是這個樣子的。

group <- c(rep("con",3),rep("treat",3)) 

前面三個是control，后面三個是treat。這時候，算出來的結(jié)果就是treat比上control，沒有問題。因為默認(rèn)情況下因子的排序是按照字母的前后順序排列的，control在treat之前。
如果我們把兩組命名為，cancer 和normal

group <- c(rep("cancer",3),rep("normal",3))

那么由于n在c的后面，所以最終的結(jié)果會變成normal比上cancer，所以的差異基因變化值都會相反。
如何 避免呢？這里要用到因子的排序。只要每次在levels里面，把真實的對照組放在前面就可以了。

group <- c(rep("con",3),rep("treat",3)) 
group <- factor(group,levels = c("con","treat"),ordered = F)

換一個名字也是一樣的，只要把對照組放在前面即可

group <- c(rep("treat",8),rep("vector",10)) 
group <- factor(group,levels = c("vector","treat"),ordered = F)

設(shè)置了分組后，接下來的操作是固定的

## 1.構(gòu)建比較矩陣design <- model.matrix(~group)## 比較矩陣命名colnames(design) <- levels(group)
design
#2.線性模型擬合
fit <- lmFit(exprSet,design)
#3.貝葉斯檢驗
fit2 <- eBayes(fit)

最終只有輸出差異基因的時候要強(qiáng)調(diào)一下,coef要選擇2。

allDiff=topTable(fit2,adjust='fdr',coef=2,number=Inf) 

其中，group不一定是要很整齊的前面是對照，后面是處理，樣本的順序可以是亂的。比如這一篇中的group也是可以的。
GEO的樣本名稱太多而且排序不規(guī)則，你們都是手動分組的么？

明天我們介紹一下limma包中的多組差異分析，三組并不需要算三次，一次就可以了。