詳細參考路徑為：https://www.dna-asmdb.com/tools/batmeth2-tutorial/bt2-pipeline.html
https://batmeth2-docs.readthedocs.io/en/latest/function/PlotMeth.html
BatMeth2軟件介紹：
Batmeth2是一款操作簡便的亞硫酸氫鹽測序（BS-Seq）分析流程工具包，它可以在允許不同長度插入缺失（Indel）情況下準確地完成亞硫酸測序序列比對。為了方便DNA甲基化數(shù)據分析，BatMeth2可以從raw reads測序數(shù)據比對到數(shù)據可視化、并最后生成HTML可視化報告文件。
相關功能包括：
亞硫酸氫鹽測序數(shù)據比對；
甲基化水平計算，包括單堿基水平的甲基化水平、基因組區(qū)域或者基因轉座子等功能區(qū)域的甲基化水平；
差異甲基化胞嘧啶/區(qū)域（DMC/DMR）檢測功能；
甲基化水平可視化。
這些功能可以作為一個全流程使用，也可以分步單獨運行，非常有利于亞硫酸氫鹽數(shù)據分析。
BatMeth2 安裝
一、安裝要求
GCC(v4.8)，GSL
SAMtools（建議>1.3.1版本）
Fastp，如果將原始數(shù)據做為輸入文件，需要這個軟件，否則不必
Fastp下載：wget http://opengene.org/fastp/fastp
Fastp權限更改: chmod 744 fastp
二、安裝Batmeth2的過程
下載軟件安裝包BatMeth2-master.zip（https://github.com/GuoliangLi-HZAU/BatMeth2）
解壓軟件安裝包BatMeth2-master.zip
將解壓后的軟件目錄“BatMeth2-master”修改為“BatMeth2”
安裝過程
cd BatMeth2
./configure
make
make copy
如果不需要gzip格式的進程文件，你可以使用以下過程安裝軟件：
cd BatMeth2
./configure
make nogzip
make copy-nogzip
BatMeth2的二進制文件將創(chuàng)建于bin目錄下
BatMeth2 分析流程
為了更方便地完成DNA甲基化數(shù)據分析，我們打包了所有功能，以完成易于使用的自動運行包，用于DNA甲基化分析。在執(zhí)行BatMeth2期間，會生成有關樣本統(tǒng)計信息的html報告。
在進行數(shù)據分析前，需要準備基因組和索引文件
首先準備fasta格式的參考基因組
對于WGBS數(shù)據，建立索引：
BatMeth2 index -g GENOME.fa
對于RRBS數(shù)據，建立索引：
BatMeth2 index_rrbs -g GENOME.fa
數(shù)據分析
對于原始數(shù)據，運行命令
###### COMMANDBatMeth2 pipel --fastp ~/location/to/fastp -1 Raw_reads_1.fq.gz -2 Raw_read_2.fq.gz -g ./batmeth2index/genome.fa -o meth -p 6 --gff ./gene.gff
經過質量過濾后的數(shù)據，運行命令：
###### COMMANDBatMeth2 pipel -1 Clean_reads_1.fq.gz -2 Clean_read_2.fq.gz -g ./batmeth2index/genome.fa -o meth -p 6 --gff ./gene.gff
BatMeth2 分析流程主要包含：測序序列質量過濾、DNA甲基化序列比對、DNA甲基化水平計算、DNA甲基化水平功能注釋以及DNA甲基化水平可視化等功能。
主要參數(shù)如下：
數(shù)據質量控制
--fastp fastp程序路徑， 如果未指定--fastp參數(shù)，輸入文件應該使用質控后的數(shù)據
序列比對
--aligner 指定比對程序，默認BatMeth2，可選程序bwa-meth, bsmap, bismark2, no(輸出目錄下已有比對結果文件)
必要參數(shù)
-i? 輸入文件，如果是雙端數(shù)據，請使用-1, -2參數(shù)，輸入文件可以使用逗號分隔
-1? 輸入文件左端的文件，如果是單端請使用-i參數(shù)
-2? 輸入文件右端的文件
-g? 比對使用的參考基因組路徑
-p? 線程數(shù)，默認6
-O? 輸出結果目錄，默認是輸出到當前目錄下（./）
-o? 輸出文件的前綴
選用其他比對軟件時：
--go 選用其他比對軟件（bsmap/bwa-meth/bismark）進行比對時，需指定該軟件對應的基因組索引文件
計算甲基化水平
--Qual? ? ? 當read質量分數(shù)>=Q，用于甲基化水平分析,默認是10
--redup? ? ? 去除PCR冗余，0或者1，默認是0.
--region? ? 設置計算甲基化水平區(qū)間大小，可用于后續(xù)差異分析，默認參數(shù)是1000bp。
-f? ? ? ? ? 對于sam格式輸出文件，包含methState屬性。[0或者1]，默認為0
--coverage? 設置最小的覆蓋度，默認是5
--binCover? 每個區(qū)域最小的nCs，默認是3
--chromstep? 染色體使用100000bp的重疊滑動窗口，步長為50000bp。 默認為：50000（bp）
DNA甲基化功能注釋
--gtf/--gff/--bed? Gtf文件，gff文件或者bed文件
--distance? ? ? ? 分布于基因bocy和上下游的DNA甲基化水平。設置上游和下游的距離，默認是2000bp
--step? ? ? ? ? ? 基因及其兩側序列使用序列長度的5%的重疊滑動窗口，步長為序列長度的2.5%，默認步長為0.025（2.5%）
-C? ? ? ? ? ? ? ? 測序覆蓋度不能超過該數(shù)值，默認是1000
--coverage? ? ? ? 設置最小的覆蓋度，默認是5
--binCover? ? ? ? 每個區(qū)域最小的nCs，默認是3
