10X公司提供兩款空間轉(zhuǎn)錄組軟件，和單細(xì)胞對(duì)應(yīng)的軟件很相似，最大區(qū)別在于增加了空間信息的可視化。那么，如何將空間信息準(zhǔn)確定位以及如何將基因表達(dá)量準(zhǔn)確mapping到空間信息中呢？ Space Ranger結(jié)合 Loupe Browser?給出了一套解決方案。
成像算法
Space Ranger依靠圖像處理算法來解決與玻片（slide ）圖像相關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵問題：
- 確定組織位置
- 校準(zhǔn)基準(zhǔn)點(diǎn)
需要組織檢測(cè)來識(shí)別哪些捕獲點(diǎn)，因此哪些條形碼（barcode）將用于分析。由于每個(gè)用戶在Visium捕獲區(qū)域成像時(shí)可能會(huì)因?yàn)橐暯遣煌O(shè)置不同，數(shù)據(jù)需要基準(zhǔn)對(duì)齊，這樣Space Ranger就可以知道圖像中單個(gè)條形碼點(diǎn)的位置。
由于圖像的尺度和大小是未知的，基準(zhǔn)幀的一個(gè)未知子集可能被組織或碎片覆蓋，每個(gè)組織都有其獨(dú)特的外觀，并且圖像的曝光可能會(huì)隨著操作的不同而不同，這些問題使圖像定位變得更加困難。
如果這里描述的任何一個(gè)過程不能充分執(zhí)行，用戶可以使用Loupe Browser.
的手動(dòng)對(duì)齊和組織選擇向?qū)?。?qǐng)注意，在大多數(shù)情況下，Space Ranger流程將無法指示發(fā)生了圖形定位方面的故障，所以鼓勵(lì)用戶檢查Space Ranger輸出的Web摘要首頁上的質(zhì)量控制圖像。
最后，為了使用這里描述的自動(dòng)分析，圖像必須使用左上角的“沙漏”基準(zhǔn)來定位:
基準(zhǔn)框架
Visium包含一個(gè)系統(tǒng)，用于識(shí)別打印在每張slide上的特定的不可見捕獲點(diǎn)模式，以及這些模式與圍繞每個(gè)捕獲區(qū)域形成框架的可見基準(zhǔn)點(diǎn)之間的關(guān)系?；鶞?zhǔn)框架具有軟件試圖識(shí)別的獨(dú)特的角和邊。
這個(gè)過程首先提取“看起來”像基準(zhǔn)點(diǎn)的特征，然后嘗試將這些候選基準(zhǔn)點(diǎn)與已知的基準(zhǔn)點(diǎn)模式對(duì)齊。從圖像中提取的斑點(diǎn)必然會(huì)包含一些遺漏，例如在基準(zhǔn)斑點(diǎn)被組織覆蓋的地方，以及一些誤報(bào)，例如在slide上的碎片或組織特征可能看起來像基準(zhǔn)斑點(diǎn)的地方。
在從圖像中提取假定的基準(zhǔn)點(diǎn)之后，該模式與已知的基準(zhǔn)點(diǎn)模式對(duì)齊，其方式對(duì)一定數(shù)量的假陽性和假陰性具有魯棒性。這個(gè)過程的輸出是一個(gè)坐標(biāo)轉(zhuǎn)換，它將Visium條形碼斑點(diǎn)模式與用戶的組織圖像聯(lián)系起來。
組織檢測(cè)
Visium 片中的每個(gè)區(qū)域都包含一個(gè)包含4992個(gè)捕獲點(diǎn)的網(wǎng)格，網(wǎng)格中填充了用于捕獲聚腺苷酸mRNA的空間條形碼探針。實(shí)際上，這些斑點(diǎn)只有一小部分被組織覆蓋。為了將Space Ranger的分析限制在那些放置了組織的點(diǎn)上，Space Ranger使用一種算法來識(shí)別輸入的brightfield圖像中的組織。
使用輸入圖像的灰度、下采樣版本，計(jì)算和比較組織切片放置的多個(gè)估計(jì)值。這些估計(jì)值用于訓(xùn)練統(tǒng)計(jì)分類器將捕獲區(qū)域內(nèi)的每個(gè)像素標(biāo)記為組織還是背景。
下面的質(zhì)量控制圖像顯示了這個(gè)過程的結(jié)果。確定為組織的單個(gè)圖像像素的顏色為淡藍(lán)色。不可見的捕獲點(diǎn)的位置在背景上用灰色圓圈表示，在組織上用深藍(lán)色圓點(diǎn)表示。
為了獲得最優(yōu)的結(jié)果，該算法期望得到的圖像具有平滑、明亮的背景和較暗、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織。如果用藍(lán)色繪制的區(qū)域與組織不一致，您可以在運(yùn)行Space Ranger之前在 Loupe Browser中執(zhí)行手動(dòng)對(duì)齊和組織選擇。有關(guān)如何改進(jìn)圖像輸入以獲得更好的結(jié)果的信息，請(qǐng)參閱故障排除部分：troubleshooting。
借助 Loupe Browser 認(rèn)為校準(zhǔn)
Space Ranger 使用自動(dòng)圖像檢測(cè)算法（ automatic image detection algorithms）來計(jì)算基準(zhǔn)標(biāo)記的位置，并找到組織的邊界。10x Genomics在各種圖像、組織和樣本上測(cè)試算法，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)算法是穩(wěn)健的。然而，在某些情況下，基準(zhǔn)標(biāo)記是模糊的，或者檢測(cè)到的輪廓不是組織邊界的確切位置。此外，某些組織，特別是那些有孔洞或縫隙的組織，可能需要更多的微調(diào)，以避免在下游分析中包括背景點(diǎn)。
Loupe Browser 4.0及以后版本為需要更多手動(dòng)干預(yù)的情況提供了Visium手動(dòng)對(duì)齊功能。該向?qū)沟靡越换シ绞綄D像對(duì)齊到slide的基準(zhǔn)標(biāo)記位置成為可能，使用一套工具執(zhí)行組織選擇，并將手動(dòng)對(duì)齊導(dǎo)出到Space Ranger運(yùn)行中。本教程將逐步介紹這個(gè)過程。
輸入定位信息
Visium手動(dòng)對(duì)齊向?qū)Э梢栽贚oupe瀏覽器的開始頁面中找到，位于左下角，在Align a Visium Image下。
單擊鏈接將啟動(dòng)向?qū)?。向?qū)У牡谝豁擄@示Visium載玻片的示意圖，包括載玻片上序列號(hào)的位置，以及載玻片上每個(gè)捕獲區(qū)域的位置。
由于點(diǎn)的位置在不同的載玻片和不同的捕捉區(qū)域之間會(huì)有細(xì)微的變化，為圖像提供正確的幻燈片和捕捉區(qū)域信息可以確保最準(zhǔn)確的定位和點(diǎn)的位置。
接下來，單擊** Input Alignment Data **， 打開 Input Data頁面，其中包含加載圖像的提示，并輸入載玻片和捕獲區(qū)域信息。
The rest of the tutorial assumes the following resources:
- Image: Download
- Slide serial: V19L29-035
- Capture area: A1
下載的是JPG格式的圖片。
打開圖片
Visium手動(dòng)對(duì)齊向?qū)Ы邮芘cSpace Ranger相同類型的圖像文件，包括:
- TIFF or BigTIFF images with 8 bytes per channel, color
- TIFF for BigTIFF images with 16 bytes per channel, grayscale
- JPEG images
單擊Open Image打開一個(gè)文件對(duì)話框，對(duì)當(dāng)前文件系統(tǒng)進(jìn)行篩選，尋找兼容的圖像文件。選擇一個(gè)文件會(huì)觸發(fā)一個(gè)簡(jiǎn)短的加載過程（這只可能發(fā)生在非常大的圖像）。如果運(yùn)行向?qū)У挠?jì)算機(jī)沒有足夠的RAM來有效地加載映像，則需要確認(rèn)向?qū)Р拍芾^續(xù)。
圖片載入后，是這樣的：
載玻片信息
輸入載玻片信息有三種選擇。
- 默認(rèn)情況下，即直接輸入slide序列號(hào)和拍攝圖像的捕獲區(qū)域，是首選的機(jī)制。此選項(xiàng)需要連網(wǎng)，因?yàn)樽钚碌膕lide信息是從10x下載的。(對(duì)于離線選項(xiàng)，請(qǐng)繼續(xù)閱讀。)在slide序列號(hào)文本框中輸入序列號(hào)(本教程中為V19L29-035)并按下“下載”按鈕將驗(yàn)證序列號(hào)并加載slide信息。如果slide號(hào)無效，或者沒有互聯(lián)網(wǎng)連接，程序?qū)@示一個(gè)提示。捕獲區(qū)域選擇器在成功輸入后可見。選擇捕獲區(qū)域?qū)⒔怄i“開Start Alignment Process”按鈕，然后執(zhí)行下一步。
下載完是這樣的：
第二個(gè)選項(xiàng)更適合脫機(jī)模式，如果映像slide的點(diǎn)偏移文件在本地可用。單擊打開的slide文件提示此類文件，其中格式為slide系列。gpr，如V19L29-035.gpr。一旦文件被加載和驗(yàn)證，捕獲區(qū)域選擇器是可見的。選擇捕獲區(qū)域?qū)⒔怄i“Start Alignment Process”按鈕，然后執(zhí)行下一步。
最后，如果圖像的序列號(hào)和捕獲區(qū)域未知或點(diǎn)偏移文件不可用，仍然可以使用第三個(gè)選項(xiàng)進(jìn)行手動(dòng)對(duì)齊。Visium手動(dòng)對(duì)齊向?qū)г趯?duì)齊步驟中使用理想的網(wǎng)格布局，而不是特定于slide的點(diǎn)偏移文件。從理想網(wǎng)格到實(shí)際滑動(dòng)位置的每個(gè)點(diǎn)的增量可能在5-15微米之間，明顯小于每個(gè)點(diǎn)的寬度。雖然光斑精度有所下降，但光斑與底層圖像之間的關(guān)系仍然是一致的。
將點(diǎn)（Spots）與圖像對(duì)齊
使用圖像中的點(diǎn)位置信息和上一步中加載的點(diǎn)偏移文件來啟用交互式手動(dòng)對(duì)齊，使用基準(zhǔn)標(biāo)記作為視覺指南。這些點(diǎn)與圖像對(duì)齊，首先以粗粒度的方式識(shí)別基準(zhǔn)標(biāo)記的中心，然后以細(xì)粒度的方式通過拖動(dòng)進(jìn)行小的調(diào)整。
對(duì)齊說明位于頁面的左側(cè)，對(duì)齊工具位于右側(cè)。仔細(xì)按照說明操作是很重要的，因?yàn)槊恳徊教崾径紩?huì)有細(xì)微的變化。完整的對(duì)齊說明不會(huì)在這里重復(fù)，但這里有一些成功的注意事項(xiàng):
- 如果其中一個(gè)角的形狀被薄紙遮住了，最好猜一猜。帶有三個(gè)角的細(xì)粒度對(duì)齊仍然會(huì)產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。
- 如果一個(gè)角X沒有居中，先處理其余的角，然后單擊清除中心重置。
-
經(jīng)過選擇和微調(diào)后，在圖像上方疊加一個(gè)紅色基準(zhǔn)幀，基準(zhǔn)標(biāo)記對(duì)齊，如下圖所示:
識(shí)別組織
選擇精確的組織邊界可以產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，減少背景驅(qū)動(dòng)聚類的可能性，并為微調(diào)測(cè)序參數(shù)提供準(zhǔn)確的spot count。當(dāng)從識(shí)別組織頁面開始時(shí)，在圖像的頂部繪制帶有條形碼的斑點(diǎn)，這些斑點(diǎn)的位置是從前面的對(duì)齊步驟推斷出來的，如下圖所示。
圖像左側(cè)的工具欄提供了各種工具來執(zhí)行粗粒度（ coarse-grained ）和細(xì)粒度（ fine-grained）的組織選擇。下表描述了這些工具。
一個(gè)典型的組織選擇工作流程從套索工具開始。通過在組織周圍拖動(dòng)套索，可以大致選擇組織對(duì)應(yīng)的區(qū)域。當(dāng)前選擇的斑點(diǎn)比未選擇的斑點(diǎn)顏色更深，如下圖所示。完成拖動(dòng)后，將出現(xiàn)一個(gè)提示。選定的點(diǎn)可以作為組織標(biāo)簽，標(biāo)簽作為背景，或選擇清除選擇取消拖動(dòng)（ Label as Tissue, Label as Background, or Clear Selection）。
以上選擇大致對(duì)應(yīng)組織的位置，所以將其標(biāo)記為組織是合適的選擇。標(biāo)記為組織的斑點(diǎn)顯示為綠色，標(biāo)記為背景的斑點(diǎn)保持為灰色，如下圖所示。
通過這種方式，套索工具可以用來創(chuàng)建大面積的組織，大面積的背景區(qū)域，或組織中的孔洞。
由于套索工具的近似性質(zhì)，在組織邊界外仍可能有標(biāo)記為組織的spot。使用縮放(Zoom )工具和更精確的標(biāo)簽作為背景橡皮擦(Eraser )工具來細(xì)化邊界。放大兩個(gè)級(jí)別，并將橡皮擦大小調(diào)整到大約兩個(gè)點(diǎn)寬，為細(xì)化前面的選擇提供了良好的控制級(jí)別。
標(biāo)簽作為組織刷(Brush )和標(biāo)簽作為背景橡皮擦(Eraser )都有可調(diào)的大小，可以通過工具欄下方的滑塊進(jìn)行配置。完成后，縮小應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)令人滿意的組織邊界。
返回到先前的步驟在向?qū)нM(jìn)行微調(diào)，作出調(diào)整，重新啟動(dòng)對(duì)齊，重新啟動(dòng)組織檢測(cè)，或輸入不同的數(shù)據(jù)。一旦對(duì)齊滿意，最后一步是將對(duì)齊文件導(dǎo)出到Space Ranger。單擊“Identify Tissue ”步驟繼續(xù)。
導(dǎo)出對(duì)齊
最后一步，導(dǎo)出到Space Ranger，顯示完整的基準(zhǔn)點(diǎn)對(duì)齊和組織選擇，如下圖所示。
這幅圖像大致反映了在Space Ranger web 摘要中顯示的對(duì)準(zhǔn)預(yù)覽。單擊相機(jī)圖標(biāo)將生成一個(gè)屏幕截圖，用于記錄對(duì)齊情況。單擊Export生成一個(gè)JSON文件，如果在輸入數(shù)據(jù)步驟中提供了該文件，則以slide 和捕獲區(qū)域命名。
該文件在spaceranger管道中用于覆蓋自動(dòng)基準(zhǔn)和組織檢測(cè)。管道操作符需要使用loupe-alignment參數(shù)運(yùn)行管道，并使用生成文件的路徑。有關(guān)更多信息，請(qǐng)參閱e Space Ranger 文檔中的手動(dòng)對(duì)準(zhǔn)說明。
$ cd /home/jdoe/runs
$ spaceranger count --id=sample345 \
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--fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
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--loupe-alignment=sample345.json # 我就是 對(duì)齊文件
