動脈粥樣硬化中的免疫細胞包括 T、B、NK 和 NKT 細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和肥大細胞。單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）技術的進展使我們對免疫細胞亞群的認識更加完善。最近的研究已經在人類動脈粥樣硬化病變和 PBMC 樣本中使用了免疫細胞的 scRNA-seq，研究證實了已知的細胞亞群，也識別出的新的免疫細胞亞群，鑒定出 HIV+?患者的 PBMC 中顯著上調基因。在這篇綜述中，總結了 scRNA-seq 在動脈粥樣硬化患者的斑塊和 PBMC 中獲得的最新數(shù)據(jù)。
【發(fā)表期刊】Cardiovascular Research（IF: 14.919）
【發(fā)布時間】2021年11月
【影響因子】10.787
【發(fā)表單位】美國加州拉霍亞免疫學研究所
1. 心血管疾病中的免疫細胞
心血管疾病仍然是世界范圍內的主要死亡原因，僅次于癌癥和 COVID-19。心血管疾病是一個廣泛的術語，包括中風、心肌梗死（MI）或外周動脈疾病。這篇綜述關注的是動脈粥樣硬化，它是大多數(shù)心血管疾病的罪魁禍首。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性動脈疾病，與血脂和低密度脂蛋白（LDL）膽固醇升高有關。雖然高膽固醇血癥是疾病發(fā)生的必要條件，但免疫機制在病變的發(fā)展、進展和易感性中起著關鍵作用?！?】易損性是指病變有破裂或侵蝕的傾向，這與斑塊帽厚度和免疫細胞含量有關?！?】
2017年，Canakinumab Antiinflammatory Thrombosis Outcome Study（CANTOS）首次證明，通過抑制炎癥反應可以降低動脈粥樣硬化心血管事件的風險?！?】在 CANTOS 中，一種靶向白介素 IL-1β?的單克隆抗體（canakinumab）被用于有 MI 病史和殘留炎癥風險的患者。接受 canakinumab 的患者經歷動脈粥樣硬化心血管事件的相對風險降低了15%，同時血液 hsCRP 和 IL-6 顯著降低。重要的是，血脂，包括 LDL 膽固醇，不受抗 IL-1β 治療的影響，強調了 canakinumab 的特異性抗炎作用。這項研究為尋找更有效、更有針對性和更安全的治療動脈粥樣硬化中殘余炎癥風險鋪平了道路。
2. 動脈粥樣硬化免疫細胞的異質性
對動脈粥樣硬化病變中免疫細胞異質性的研究始于20世紀80年代的免疫染色，當時可以對兩種標記物進行染色。組織中的免疫染色最近被細化到可以分辨大約16種標記物。流式細胞術于2006年被引入動脈粥樣硬化的研究，標志物的范圍得到擴展。隨著技術發(fā)展，細胞質譜（CyTOF）可以檢測大約40個標記。本文聚焦目前可用的最高分辨率的方法：單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）、單細胞表面蛋白測序（多達200個抗體）、單細胞免疫組庫。
3.人類動脈粥樣硬化病變的單細胞轉錄組測序
以下匯總了動脈粥樣硬化患者的斑塊和/或 PBMC 中免疫細胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)?！?7-20】圖1顯示了動脈粥樣硬化動脈中小鼠和人髓系細胞在同一 UMAP 中的整合。這三項研究【17, 18, 20】的主要目標是將 scRNA-seq 特征與心血管事件聯(lián)系起來。一項研究【20】聚焦于發(fā)現(xiàn)白細胞亞群異質性及其轉錄組特征。三項研究集中在免疫細胞亞群，而 Wirka 等【18】主要涉及平滑肌細胞（SMC）表型。表1概述了這些研究的技術比較。近年來，從血管中分離免疫細胞的技術挑戰(zhàn)包括酶消化、雙細胞、死亡細胞、細胞應激、批次效應等?！?6-30】?酶促的組織消化和機械的組織分解可能導致某些細胞類型的不均勻損失，這可能解釋了在整個研究中觀察到的可變性。T 細胞比體積大而脆弱的巨噬細胞或樹突狀細胞更能在分離過程中存活下來。酶消化過程中的細胞應激反應會影響研究結果。scRNA-seq 主要產生高表達基因，系統(tǒng)缺失低表達基因。由于消化程序、樣本類型和樣本收集方面的差異，以及實驗差異，對這些研究進行直接比較具有挑戰(zhàn)性。人動脈粥樣硬化動脈主要免疫細胞亞群的關鍵標記基因如圖2所示。
表1人類 scRNA-seq 研究的技術信息
人類斑塊 scRNA-seq 的基礎文章【17】分析了通過頸動脈內膜剝脫術獲得的人類斑塊和匹配的 PBMC 中的白細胞。頸動脈內膜剝脫術樣本含有斑塊、纖維帽，有時也有頸動脈中層的一部分，但沒有外膜。用 10x Genomics 3’ scRNA-seq 聯(lián)合表面抗體分析了來自同一患者的 PBMC（1654個細胞）和頸動脈內膜剝脫術樣本（254個細胞）。另外4例無癥狀和2例有癥狀的頸動脈內膜剝脫術樣本采用3’ scRNA-seq 進行分析。
作者在斑塊和血液中發(fā)現(xiàn)了16個 T 細胞群（表2）。出乎意料的是，CD8+?T 細胞主要在斑塊(46%)中富集。血液 T 細胞轉錄組主要富集靜息 CD4+?T 細胞，表達抑制 T 細胞功能的基因（KLF2?和?TXNIP）。斑塊 T 細胞表達的基因與 T 細胞活化（NFATC2，FYN，ZAP70）、細胞毒性（GZMA，GZMK）和 T 細胞衰竭（EOMES，PDCD1，LAG3）相關。斑塊 CD4+?T 細胞處于激活的促炎狀態(tài)。
表2人 scRNA-seq 檢測的免疫細胞亞群
雖然表面抗體檢測只在一個斑塊樣本中使用，但它識別出5個不同的巨噬細胞亞群。Cluster 1表達了參與巨噬細胞激活的基因（HLA-DRA?和?CD74）。Cluster 2高度炎癥，表達的基因參與炎癥反應（CYBA，LYZ，S100A9/8，AIF1），Toll 樣受體結合（S100A9/8），氧化還原酶活性（CYBA）和金屬蛋白酶抑制（IMP1）。cluster3 中上調的基因參與促炎癥反（JUNB,?NFKBIA），高表達?MALAT1。這些細胞群可能與小鼠動脈粥樣硬化中發(fā)現(xiàn)的炎性巨噬細胞相關（圖1）【16】。Cluster 5 表達的基因參與膽固醇攝取和代謝（APOC1,?APOE）和脂質積累（PLIN2），類似于小鼠動脈粥樣硬化中的?TREM2?泡沫細胞?！?6】這些巨噬細胞顯示出促炎信號減弱（IL-1, IFN），這與泡沫細胞的抗炎性質一致。共46個樣本（29個來自無癥狀患者，17個來自有癥狀患者）進行了細胞質譜檢測【13，14】，僅獲得2個可區(qū)分的巨噬細胞亞群。在 CyTOF 中使用和挑選的標記的數(shù)量，盡管提供了信息，但比在 scRNA-seq 中要少，這導致了免疫細胞亞群的分辨率較低。Vallejo【20】等在32個樣本上使用了40種寡核苷酸標記的抗體，從而將類似于 CyTOF 的精確細胞表面表型與轉錄組結合起來。
Wirka等【18】使用了從移植心臟分離的人冠狀動脈細胞。與頸動脈內膜剝脫術樣本不同，這些樣本包括外膜細胞。這項研究主要集中在 SMCs 和成纖維細胞樣細胞（fibromyocyte），但這里只回顧了發(fā)現(xiàn)的免疫細胞亞群（巨噬細胞、T 細胞、B 細胞和 NK 細胞）。作者使用了 10x Genomics 平臺和 PE150 測序。過濾少于500個基因的細胞和少于5個細胞表達的基因。通過丟棄含有超過3500個基因的細胞，可以減少雙細胞。線粒體基因含量在7.5%以上的細胞被認為是死細胞。作者鑒定了7個免疫細胞群：表達?RNASE1、C1QA、C1QC、C1QB?和?CD14?的巨噬細胞；表達?IL32、TRAC、IL7R、CCL5?和?CD3D?的 T 細胞；表達?CD79A、CD37、MS4A1、LTB、CD52?的 B 細胞；表達?IGHM、JCHAIN、IGLC3、IGHV3-73、MZB1?的?IgM?漿細胞；表達IGHG2、IGHGP、MZB1、DERL3?的?IgG?漿細胞；表達?NKG7、GNLY、PRF1、GZMB、CCL5?的 NK 細胞；表達?TPSAB1、CPA3、C1orf186、SLC18A2、MS4A2?的肥大細胞。
關于人類斑塊 scRNA-seq 的第三篇文章發(fā)表于2020年12月。斑塊來自于頸動脈內膜剝脫術，14名男性和4名女性。Depuydt 等【19】使用 CD3、CD68、CD34 和抗 SMC 抗體對三個匹配的樣本進行免疫組化分析。在這四種抗體范圍內，免疫熒光數(shù)據(jù)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)一致。CEL-Seq2 技術提供的轉錄組深度比 10× Genomic 技術要深得多，但成本高得多，捕獲的細胞也少得多。作者著重研究了斑塊中不同細胞類型的特異性基因或與冠狀動脈疾病相關的基因。在確定的11個免疫細胞群中，5個是淋巴細胞群，5個是髓細胞群，1個無法確定。共使用7種不同的抗體（CD45-PECy7、CD3-BV421、CD4-PETR、CD28-BV650、Granzyme B-PE、TruStain Fcx 和 Fixable Viability Dye-eFluor 780）將細胞分選到孔中。
作者發(fā)現(xiàn)了 CD4+?T 細胞的五個亞群（圖2）。兩個亞群具有細胞毒性，其中一個亞群表達PRF1、GZMA?和?GZMK，但很少表達?CD28，這表明這些細胞可能是 CD4+??CD28null39，另一個亞群表達?GZMA、GZMK?和?CD28。CD4+??初始 T 細胞的一個亞群表達?IL7R、LEF1?和?SELL。通過?FoxP3、IL2RA?和?CTLA4?鑒定出 CD4+?調節(jié)性 T 細胞；CD4+?中心記憶 T 細胞表達?LEF1、IL7R?和?SELL。CD8+?T細胞的三個亞群中，GZMK+?效應記憶T細胞表達GZMK，GZMA?和?CD69；終末分化細胞毒性 CD8+?T 細胞亞群表達?GZMB，TBX21，NKG7，GNLY，ZNF683?和?CX3CR1，缺乏?CD69；CD8+?中央記憶 T 細胞表達?LEF1，SELL，IL7R?和?LTB。
在最初的聚類中，Depuydt 等【19】發(fā)現(xiàn)了5個髓系細胞群：由?HDC、KIT、CMA1、TPSAB1?鑒定的肥大細胞群和4個表達?CD14?和?CD68?的細胞群。這四個群進一步細分，獲得五種不同的巨噬細胞。2個炎性巨噬細胞亞群分別表達?IL1B、CASP1、CASP4、KLF4?和?KLF4、IL1B、TLR4、ABCA1、TNF、IL18、CD9，分別命名為 IL1B+?和 TNF+?炎性巨噬細胞。ABCG1+泡沫巨噬細胞表達?ABCA1、ABCG1、MMP9、OLR1、TREM2、CD9、ACTA2、LGALS3、CD68、IL18?和?CD9。CD1c+?樹突狀細胞亞群表達?CD1c、CLEC10A?和?FCER1A。
與 Fernandez【17】和 Winkels【14】等人的研究一樣，T 細胞占分析細胞的大多數(shù)（52%），而髓系細胞僅占19%。對 Winkels 小鼠數(shù)據(jù)【14】和其他8個小鼠數(shù)據(jù)【16】的薈萃分析表明，T細胞的富集是由于髓系細胞的缺失，很可能是由樣品消化過程引起的。巨噬細胞不如圓形淋巴細胞耐消化處理，因此，F(xiàn)ernandez【17】和 Depuydt【19】等人發(fā)現(xiàn)的髓系細胞的比例低，巨噬細胞會優(yōu)先缺失。此外，頸動脈內膜剝脫術樣本缺乏大部分中膜和所有外膜，而這些正是巨噬細胞存在的地方。
最近的關于動脈粥樣硬化的 scRNA-seq 研究【20】是對31名女性受試者的 PBMC 樣本進行的，其中16人有亞臨床動脈粥樣硬化，由頸動脈超聲確定。在31名被研究的女性中，有24人攜帶艾滋病毒，大多數(shù)人的病毒載量無法檢測到。該研究使用 BD Rhapsody 檢測485個基因和40個抗體?？偣搏@得了32000個細胞，鑒定出58個不同的亞群，包含CD4+?T 細胞、CD8+?T 細胞、B 細胞、NK 細胞和單核細胞。為了檢測心血管疾病的變化，他們分析了患有和不患有心血管疾病的受試者之間的基因變化。所有這些受試者都是 HIV 陽性。
在 CD4+?效應記憶 T 細胞中，CVD 組?IL-32?顯著升高。IL-32 是一種炎癥細胞因子，已知在心血管疾病中起重要作用。在 CD4+?初始 T 細胞中，IL-32、SELL、SELPLG?和?CCR7?在 CVD 組中也顯著增加。其中一個 CD4+?效應記憶 T 細胞顯示?TRAIL?的顯著上調。在 CD8+終末分化記憶T細胞，IL32?在 CVD 女性患者中較高，在 CD8+?初始 T 細胞群中也是如此。在一個 EMRA CD8+?T 細胞群中，CD52、TRAC?和?HOPX?在 CVD 組顯著上調，一些殺傷細胞凝集素受體（KLRC4、KLRD1、KLRG1?和?KLRK1）也在 CVD 組上調。趨化因子 CCL5 及其主要受體 CCR5 參與動脈粥樣硬化、心肌梗死的發(fā)展。CCL5 編碼趨化因子 RANTES，已知在動脈粥樣硬化中起重要作用。CCL5 或其受體在動物模型中有助于減少新內膜形成，巨噬細胞浸潤以及動脈粥樣硬化斑塊的形成。在一些研究中，CCL5 也被用作可能的 CVD 生物標志物。最后，在 CD8+?效應記憶 T 細胞中，CVD 與?IL32、TRAC、HOPX、CCL5?和殺傷凝集素受體?KLRK1、KLRC4、KLRD1?顯著升高相關。
在一個典型單核細胞群中，CVD 與?CCL4、SLC2A3、SOD2?和?SELPLG?顯著增加相關。在另一個經典單核細胞群中，TNF、DUSP1、TRAIL、APRIL?和?BAFF?與 CVD 高度相關。CCL3、CCL4、IL1B、TLR2?和?DUSP2，已知與動脈粥樣硬化相關，在CVD組的第三個經典單核細胞群高度上調。
4.總結
在沒有表面標記物的情況下，使用 scRNA-seq 轉錄組來區(qū)分 CD4+?T 細胞和 CD8+?T 細胞仍然具有挑戰(zhàn)性。細胞表面表型信息的添加大大提高了免疫細胞的識別， Fernandez 等人【17】（21個寡核苷酸標記抗體）和 Vallejo 等人【20】（40個寡核苷酸標記抗體）闡述了這項技術的力量?，F(xiàn)在，多達 200 種抗體可用于人類和小鼠細胞，與 scRNA-seq 結合，將提高免疫細胞亞群的分辨率，并增加發(fā)現(xiàn)新細胞亞群的機會。為了研究動脈粥樣硬化特征基因，必須包含健康對照，這在基于內膜切除術的研究中是不可能的，但可以使用 PBMC 和移植心臟的非動脈粥樣硬化冠狀動脈。scRNA-seq 結合細胞表面表型將提高人類動脈粥樣硬化免疫細胞圖譜的分辨率和質量。
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