慢病毒包裝步驟
第1天：我們常規(guī)使用的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)包括1個(gè)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（Transfer plasmid）、1個(gè)膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒（Envelope plasmid）、2個(gè)包裝質(zhì)粒（Packaging plasmids），將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。2個(gè)包裝質(zhì)粒分別為Gag/Pol表達(dá)質(zhì)粒和Rev表達(dá)質(zhì)粒。
第3天：在細(xì)胞里，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出攜帶目的基因（Gene of Interest，簡(jiǎn)稱GOI）的HIV RNA基因組，與包裝質(zhì)粒表達(dá)出的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白、酶、調(diào)控蛋白組裝成病毒顆粒后，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，形成包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白質(zhì)粒表達(dá)的VSV-G膜蛋白錨定在細(xì)胞膜上，隨著病毒成熟，與細(xì)胞膜一起成為了病毒的膜。細(xì)胞短暫孵育后，收集上清，離心去除細(xì)胞碎片并過(guò)濾。
第4天：PEG濃縮病毒顆粒。對(duì)于超純化慢病毒（體內(nèi)應(yīng)用級(jí)別），采用蔗糖離心方法進(jìn)一步純化、濃縮病毒。
第5天及以后：對(duì)病毒進(jìn)行滴度測(cè)定（Titer determination）、微生物檢測(cè)（Bioburden test，針對(duì)細(xì)菌、真菌）、支原體檢測(cè)（Mycoplasma test）等。
若轉(zhuǎn)移載體同時(shí)編碼一個(gè)熒光蛋白，我們還會(huì)將病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)以測(cè)定相應(yīng)的熒光表達(dá)情況（Transduction test）。此外，對(duì)于超純化慢病毒，我們還可以檢測(cè)內(nèi)毒素水平（Endotoxin test）。
慢病毒操作中的常見(jiàn)問(wèn)題
Q1.?用于慢病毒感染的細(xì)胞接種量多少才合適呢？
A.?以在感染 3 天左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部為宜，不同細(xì)胞根據(jù)其生長(zhǎng)速度靈活調(diào)整接種量
Q2.?慢病毒感染后細(xì)胞狀態(tài)異常？
A.?出現(xiàn)這種情況時(shí)，有幾個(gè)主要原因：
(1）首先，確定是否有支原體或者細(xì)菌污染
(2）可能是 MOI（感染復(fù)數(shù)）過(guò)高，需要摸索尋找最適合的 MOI
(3）同時(shí)考慮目的細(xì)胞可能比較敏感，更換其它細(xì)胞感染確定病毒是否有問(wèn)題
(4）如果以上都排除后細(xì)胞狀態(tài)仍然不好，嘗試增加血清含量，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否好轉(zhuǎn)
Q3.?慢病毒感染效率低怎么辦，如何提高慢病毒感染效率？
A.?慢毒感染效率低，主要需要考慮的問(wèn)題有：
(1）細(xì)胞是否適合用慢病毒進(jìn)行感染？（慢病毒適用于大部分細(xì)胞系，例如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，但也有一些細(xì)胞不適合用慢病毒感染，可能更適合用腺病毒，可查閱文獻(xiàn)，或咨詢我們）
(2）慢病毒是否進(jìn)行了正確的存儲(chǔ)和稀釋?zhuān)咳绻《敬鎯?chǔ)不當(dāng)或反復(fù)凍融會(huì)降低病毒活性，從而導(dǎo)致感染效率降低
(3）感染操作問(wèn)題：首先排查 MOI 是否合適；其次可以使用海星生物推薦的 1/2 體積感染法來(lái)增加感染效率；最后感染換液（一般 24 h）及觀察的時(shí)間是否合適
(4）對(duì)于一些難感染細(xì)胞的感染方法：例如懸浮細(xì)胞可使用平角離心轉(zhuǎn)染法，其他一些較難感染的細(xì)胞可進(jìn)行二次感染
(5）可以添加助轉(zhuǎn)染試劑 polybrene 增加感染效率
Q4.?慢病毒感染細(xì)胞熒光表達(dá)較弱？
A. 熒光蛋白的亮度與啟動(dòng)子、表達(dá)方式和連接原件等有關(guān)：
(1）不同啟動(dòng)子誘導(dǎo)熒光蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱不同，如 UBC 相對(duì)于 EF1α、CAG、CMV 等強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)較弱
(2）融合或非融合表達(dá)與熒光強(qiáng)度也有很大關(guān)系，融合表達(dá)時(shí)熒光蛋白可能出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊等現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測(cè)不到熒光信號(hào)或熒光較弱；非融合表達(dá)時(shí)一般選擇連接肽作為連接原件，如 2A 肽或 IRES 將 ORF 分隔開(kāi)
(3）帶熒光的慢病毒感染細(xì)胞后，熒光的強(qiáng)度取決于病毒進(jìn)入到細(xì)胞的顆粒數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞類(lèi)型、觀察時(shí)間等因素，熒光表達(dá)的強(qiáng)度與目的細(xì)胞感染病毒的顆粒數(shù)正相關(guān)，一般感染細(xì)胞后72h 觀察熒光強(qiáng)度最佳，而增殖較慢的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間
(4）也可能會(huì)遇到過(guò)表達(dá)的慢病毒比對(duì)照的熒光要暗的情況，這主要是因?yàn)榛虻牟迦?，?huì)影響位于下游的熒光蛋白表達(dá)
Q5.?在篩選穩(wěn)定細(xì)胞株時(shí)，為什么細(xì)胞熒光正常，藥物篩選后大量熒光陽(yáng)性細(xì)胞死亡？
A.?出現(xiàn)這種情況時(shí)，有幾個(gè)主要的原因：
(1）抗性基因由弱啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)較弱
(2）抗性基因表達(dá)在 IRES 之后
(3）使用藥物劑量過(guò)高
Q6.?為什么慢病毒穩(wěn)定株會(huì)出現(xiàn)表達(dá)或者干擾效果丟失？
A.?慢病毒是 RNA 病毒，感染細(xì)胞后會(huì)整合進(jìn)細(xì)胞基因組，因此理論上該基因一直都會(huì)表達(dá)。但并不意味著穩(wěn)定株一直傳代是一個(gè)好的選擇；
因?yàn)橐环矫?，?xì)胞傳代次數(shù)增加可能使得該細(xì)胞干擾或者過(guò)表達(dá)的基因受到代償機(jī)制的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致多次傳代后干擾和過(guò)表達(dá)效果下降，另外一方面，細(xì)胞本身隨著傳代增加其理化性質(zhì)會(huì)逐漸變化，比如原代細(xì)胞隨著傳代次數(shù)增加細(xì)胞逐漸老化，基因表達(dá)譜變化本身就會(huì)很明顯，又比如永生化細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞隨著傳代次數(shù)增加其積累突變也是增加的，這也會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)譜變化。因此建議，穩(wěn)定株構(gòu)建好之后可以多凍存代數(shù)較早的細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)盡量使用代數(shù)靠前的細(xì)胞。
