科研靈感從哪里來，當(dāng)然是從文獻(xiàn)來啊。
近日，發(fā)表在Nature的一篇文章《APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer’s disease?microglia》，將脂滴與阿爾茲海默癥聯(lián)系起來。
無疑，大大擴(kuò)展了我們對(duì)阿爾茲海默癥發(fā)病機(jī)理的認(rèn)知。
我們知道，科學(xué)問題對(duì)于一項(xiàng)科學(xué)研究至關(guān)重要。小編看見這篇文章的第一個(gè)念頭就是，為什么他們要去探究脂滴和阿爾茲海默癥之間的關(guān)系呢？
帶著這個(gè)疑問去閱讀文章，發(fā)現(xiàn)竟是由一篇Meta分析帶來的靈感。
這篇meta分析文章《Genetic meta-analysis of diagnosed Alzheimer’s disease identifies new risk loci and implicates Aβ, tau, immunity and lipid processing》于2020年發(fā)表于Nature genetics。
如題所示文章通過Meta分析確定了新的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，涉及到Aβ、tau、免疫和脂質(zhì)加工。
該文章給了作者靈感：脂質(zhì)可能和阿爾茲海默癥有關(guān)。于是作者展開了對(duì)脂質(zhì)和阿爾茲海默癥關(guān)系的探究。
那么我們來看看作者是怎樣安排實(shí)驗(yàn)的。
首先，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序安排，由于大量的阿爾茲海默癥患者腦組織標(biāo)本為冰凍標(biāo)本，難以進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，作者選擇了單核RNA測(cè)序。作者將標(biāo)本分為三個(gè)組別，依次是患有?AD 且具有APOE4/4 基因型的個(gè)體，患有?AD 和 APOE3/3 基因型的個(gè)體，具有APOE3/3 基因型的年齡和性別匹配的對(duì)照個(gè)體。
為什么要選擇APOE基因呢？因?yàn)?b>APOE與脂質(zhì)代謝相關(guān)，且是研究最為廣泛的阿爾茲海默癥風(fēng)險(xiǎn)基因，臨床診斷時(shí)APOE基因分型可作為一項(xiàng)對(duì)阿爾茲海默癥診斷的評(píng)估內(nèi)容。APOE有三個(gè)等位基因ε2、ε3和ε4，其中ε2?等位基因通常被認(rèn)為對(duì)阿爾茨海默病具有保護(hù)作用；ε3?等位基因被認(rèn)為是中性的；ε4?等位基因與阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。
對(duì)單核RNA測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行差異基因分析，作者發(fā)現(xiàn)ACSL1是最顯著的差異基因，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，ACSL1在小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)。
第二步，表型（大多數(shù)表型是首先出場(chǎng)，文中放到第二步，當(dāng)然也亦無不可），作者通過對(duì)三組患者標(biāo)本進(jìn)行油紅染色及阿爾茲海默模型鼠海馬體中小膠質(zhì)細(xì)胞（標(biāo)志物IBA1染色），中性脂質(zhì)（LipidSpot染色），證實(shí)了脂質(zhì)積累確實(shí)與阿爾茲海默癥病理學(xué)相關(guān)。
第三步，表型進(jìn)一步驗(yàn)證。作者將含APOE4/4或APOE3/3?的iPS細(xì)胞(iPS細(xì)胞為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）分化為小膠質(zhì)細(xì)胞（iMG），用中性脂質(zhì)熒光染料?（LipidSpot）染色，發(fā)現(xiàn)與APOE3/3 iMG?相比，APOE4/4 iMG?中的脂滴積累更多。此外，用原纖維?Aβ?（fAβ）處理iMG細(xì)胞（fAβ?處理細(xì)胞是模擬阿爾茨海默癥發(fā)病的常用體外模型），也觀察到同樣結(jié)果。為了避免該現(xiàn)象為iMG細(xì)胞特有，作者在原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞，原代人巨噬細(xì)胞和小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中都觀察到類似現(xiàn)象。此外，通過透射電鏡還觀察到fAβ處理時(shí)iMG中的脂滴濃度增加，作者進(jìn)一步用CARS成像發(fā)現(xiàn)脂滴光譜與不飽和甘油三酯光譜重疊。那么，這些增加的脂滴是否響應(yīng)fAβ處理后的從頭合成呢？帶著這一問題，作者用氘代葡萄糖（d-葡萄糖）培養(yǎng)BV2?小膠質(zhì)細(xì)胞，通過脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在fAβ處理后，d-葡萄糖的甘油三酯摻入隨時(shí)間依賴性增加。問題又來了，哪些脂質(zhì)合成基因在脂質(zhì)積累中起作用呢？作者通過流式細(xì)胞分選對(duì)單核細(xì)胞系U937進(jìn)行了全基因組CRISPR-KO篩選，發(fā)現(xiàn)ACSL1是脂滴形成的核心基因，且通過ACSL1抑制劑（Triacin C)可以消除經(jīng)fAβ處理后在APOE4/4 iMG中脂滴的積累。
第四步：機(jī)制探究。為了評(píng)估具有脂滴積累的小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳狀態(tài)，作者對(duì)脂滴高和脂滴低iMG進(jìn)行了FACS分選，然后進(jìn)行了ATAC-seq和RNA-seq。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)脂滴積累高的小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性峰顯示與NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。但是作者并沒有深入展開對(duì)NF-κB通路的研究（估計(jì)是該通路太爛熟了），而是基于差異基因，鑒定出抗菌相關(guān)蛋白cathelicidin或CAMP，經(jīng)過分析并結(jié)合溶酶體和趨化因子的檢測(cè)，作者得出結(jié)論，含脂滴的APOE4/4 iMG在吞噬作用中功能失調(diào)，積累溶酶體并分泌炎癥因子。
做到這里，難免給人一種內(nèi)容較為單薄大的感覺。因此，作者繼續(xù)探究經(jīng)fAβ處理后在?iMG?中脂滴積累的調(diào)控因子，使用靶向所有人類激酶、磷酸酶和已知藥物靶標(biāo)的約?2,000?個(gè)基因的“可成藥基因組”進(jìn)行CRISPR-KO篩選，發(fā)現(xiàn)最顯著的基因是PIK3CA，于是作者測(cè)試了小分子PI3K抑制劑GNE-317對(duì)?iMG脂滴積累的影響，發(fā)現(xiàn)確實(shí)能減少脂滴積累，機(jī)制涉及到PI3K/mTOR?和自噬通路，同樣的，作者也是點(diǎn)到為止，沒有特別深入展開研究。
接下來，作者做了一項(xiàng)有意思的實(shí)驗(yàn)。將APOE4 / 4 iMG分為L(zhǎng)D高（前10%BODIPY信號(hào)）和LD低（后10%BODIPY信號(hào)）兩部分，并在神經(jīng)基底培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。用上述條件培養(yǎng)基及未經(jīng)處理的對(duì)照完全培養(yǎng)基對(duì)APOE4 / 4 iPS細(xì)胞來源的人神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)而探究脂滴積累的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂滴高度積累的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)元中的Tau磷酸化和凋亡。
作為一篇頂刊文章，本文有哪些優(yōu)點(diǎn)呢？
科學(xué)問題新穎，確立了阿爾茲海默癥與脂質(zhì)關(guān)系的探究
2.研究手法巧妙，找到了脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因ACSL1，由于該基因在脂肪酸代謝中研究較為普遍，作者并不是圍繞該基因展開研究，而是順勢(shì)引入了脂滴，這就是畫龍點(diǎn)睛了。
3，在機(jī)制方面，作者本想通過測(cè)序及CRISPR-KO?篩選發(fā)現(xiàn)一些新的靶標(biāo)，可事與愿違，我們不難發(fā)現(xiàn)作者陷入了困境，盡管有所發(fā)現(xiàn)，但諸如NF-κB及通過自噬等通路降低脂滴水平均是前人研究過的，缺乏新意。不過有相當(dāng)工作量體現(xiàn)，并且在機(jī)制無法深入展開，作者選擇用脂滴高的?iMG條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)神經(jīng)元Tau磷酸化和凋亡，也是很好的創(chuàng)意。
值得一讀！
參考文獻(xiàn)：
1. Haney MS, Pálovics R, Munson CN, Long C, Johansson PK, et al. 2024. APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer's disease microglia. Nature 628:154-61
