文章導(dǎo)讀

SARS-CoV-2感染后臨床癥狀表現(xiàn)不一，越來越多感染人員處于SARS-CoV-2沉默感染階段（SSIS），其中部分感染人員從核酸陽性到陰性，從始至終不出現(xiàn)相關(guān)臨床癥狀表現(xiàn)，屬于持續(xù)無癥狀感染者（persistently asymptomatic subjects），而部分感染人員在經(jīng)過潛伏期后，隨病程進(jìn)展出現(xiàn)相關(guān)臨床表現(xiàn)，屬于潛伏期無癥狀感染者（presymptomatic subjects）。目前已有相關(guān)研究報(bào)道了COVID-19患者急性期（如輕癥、普通型、重癥和危重癥）免疫反應(yīng)特點(diǎn)。然而，對于SSIS階段的感染者，為什么有些人會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，而有些人自始至終都不會(huì)？其中的免疫學(xué)特征知之甚少。因此，上海交通大學(xué)瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科瞿介明教授、瑞金醫(yī)院上海血液學(xué)研究所諸江教授和上海公共衛(wèi)生臨床中心盧洪洲教授相關(guān)團(tuán)隊(duì)工作人員首次剖析了區(qū)分持續(xù)無癥狀感染者和潛伏期無癥狀感染者的主要免疫學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)了影響SARS-CoV-2感染者在SSIS時(shí)期疾病朝不同方向進(jìn)展的關(guān)鍵免疫機(jī)制。

文章研究思路

研究人員聯(lián)合使用CyTOF、RNA-seq和OIink技術(shù)對年齡、性別相當(dāng)，無明顯免疫異常的并發(fā)癥的19名持續(xù)無癥狀感染者、12名潛伏期無癥狀感染者、47名輕型或普通型COVID-19患者以及27名健康志愿者的外周血標(biāo)本進(jìn)行聯(lián)合分析，揭示了可以區(qū)分持續(xù)無癥狀感染者和潛伏期無癥狀感染者特有的免疫學(xué)變化。

文章研究思路

CyTOF闡述持續(xù)無癥狀感染者和潛伏期無癥狀感染者淋巴細(xì)胞免疫圖譜差異

利用CyTOF技術(shù)，研究人員通過38個(gè)免疫細(xì)胞表面分子標(biāo)志物鑒定了包括NK細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒前體細(xì)胞在內(nèi)的35個(gè)細(xì)胞亞群（Fig 2.a-b）。

研究發(fā)現(xiàn)與持續(xù)無癥狀感染者相比，潛伏期無癥狀感染者CD62Lhi CD8+ Tna?ve細(xì)胞比例明顯下降，MAIT比例有下降趨勢，而CD4+ CD161hi NKT細(xì)胞比例上升（Fig 2.e-g），這可能與細(xì)胞的過度活化有關(guān)；相較于健康對照組，持續(xù)無癥狀感染者CD8+ Tna?ve細(xì)胞和MAIT比例基本不變，邊緣區(qū)B細(xì)胞亞群增多，NKT細(xì)胞亞群不變，淋巴細(xì)胞的CD44表達(dá)上調(diào)、PD-1表達(dá)下調(diào)（Fig.h-l），研究人員推測這種免疫應(yīng)答模式可能有助于形成保護(hù)性免疫，避免出現(xiàn)免疫耗竭。

Fig.1?CyTOF剖析淋巴細(xì)胞組成

潛伏期無癥狀感染者具有單核細(xì)胞過度活化和分化阻滯特征

研究人員通過CyTOF對單核細(xì)胞亞群進(jìn)一步研究，分析發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，潛伏期無癥狀感染者和輕型、普通型COVID-19患者的CD107alow經(jīng)典型單核細(xì)胞、過渡型單核細(xì)胞和非經(jīng)典型單核細(xì)胞減少，而持續(xù)無癥狀感染者只有中間型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞明顯減少(Fig 2.c-e)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CD107ahigh與CD107alow經(jīng)典型單核細(xì)胞的比值在潛伏期無癥狀感染者和輕型、普通型COVID-19患者組別中相較于健康對照組和持續(xù)無癥狀感染者明顯增高（Fig 2.e），兩者比值增高反映單核細(xì)胞處于過度活化狀態(tài)；此外，偽時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)潛伏期無癥狀感染者CD107alow經(jīng)典型單核細(xì)胞向過渡型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞分化受阻(Fig 2.f)。與持續(xù)無癥狀感染者相比，潛伏期無癥狀感染者存在單核細(xì)胞過度活化和分化阻滯的現(xiàn)象。

隨后，研究人員進(jìn)行分層聚類以進(jìn)一步評估CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群差異對區(qū)分不同感染人群的影響，研究發(fā)現(xiàn)CD107alo ?C-Mo, I-Mo and NC-Mo亞群之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)性，NKT（T15）亞群與CD107aloCMo、I-Mo、NC-Mo或CD8+Tna?ve簇（T04）之間具有負(fù)相關(guān)性（Fig 2.i-j）。這些研究結(jié)果表明，異常單核細(xì)胞激活和分化阻滯在構(gòu)建特殊的免疫細(xì)胞成分改變模式中具有潛在作用，該模式可能預(yù)示區(qū)分SSIS的無癥狀持續(xù)感染和潛在感染患者。

RNA-seq揭示新冠病毒感染后免疫改變的分子機(jī)制

隨后研究人員通過RNA-seq技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了單核/巨噬細(xì)胞活化、分化和功能異常與處于SSIS感染者疾病進(jìn)展方向密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，單核/巨噬細(xì)胞的浸潤、功能激活和分化潛能，NF-kB信號通路的活化，與持續(xù)無癥狀感染者正相關(guān)；而I型干擾素信號通路、病毒復(fù)制抑制、抗原提呈、TNF和IFNγ信號通路、免疫缺陷、淋巴細(xì)胞耗竭、NKT信號通路，以及SARS-CoV相關(guān)病毒的感染反應(yīng)，與潛伏期無癥狀感染者顯著正相關(guān)(Fig 3.b-g)。此外，與持續(xù)無癥狀感染者相比，潛伏期無癥狀感染者單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和抗病毒功能相關(guān)基因FAM110B、PPP1R17、CTDSPL和NOX1表達(dá)下調(diào)。相比之下，I型干擾素刺激基因如XAF1、IFI44、IFI44L、LAMP3、RSAD2、MX1和USP18以及免疫抑制基因包括SPP1、UTS2、EGR3和P2RY6在潛伏期無癥狀感染者中顯著上調(diào)（Fig 3.h-k）。值得注意的是，促炎基因如CCR5、PAK3和LPAR3在潛伏期無癥狀感染者中富集，而抗炎基因IL12B在持續(xù)無癥狀組中更富集，表明促炎基因激活和免疫抑制之間可能存在因果關(guān)系。

Fig.3?持續(xù)無癥狀感染者和潛伏期感染者PBMC相關(guān)信號通路功能差異

Olink技術(shù)檢測新冠感染者外周血血漿蛋白

研究人員通過Olink技術(shù)系統(tǒng)檢測了180種外周血血漿蛋白種類，以系統(tǒng)描述SARS-CoV-2感染者分泌的炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)包括與單核細(xì)胞相關(guān)的MMP-1, CLEC4A, LY75和STC1在內(nèi)共7種炎癥因子在持續(xù)無癥狀感染者和潛伏期無感染者中存在差異（Fig 4.e-f）。

與持續(xù)無癥狀感染者不同的是，潛伏期無癥狀感染者中MMP-1水平較健康者增高，而STC1水平明顯下降，對結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)MMP-1與單核細(xì)胞功能標(biāo)志物CLEC4A、LY75水平呈負(fù)相關(guān)；相反的，STC1與二者呈正相關(guān)（Fig 4.g-h）。此外，STC1與CD107alo C-Mo、I-Mo和NC-Mo單核細(xì)胞顯著正相關(guān)（Fig 4.i-j）。這些研究表明STC1是限制單核細(xì)胞活化的關(guān)鍵因子之一，可以抑制MCP-1促進(jìn)非經(jīng)典型單核細(xì)胞活化和遷移的作用，同時(shí)也是MMP-1負(fù)調(diào)控因子。

Fig.4?SSIS患者血漿炎癥因子的特征差異

區(qū)分持續(xù)無癥狀感染者和潛伏期無癥狀感染者的免疫特征

最后，研究人員利用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了兩種關(guān)鍵因子STC1和MMP-1，研究發(fā)現(xiàn)SSIS感染者血漿中這兩種因子水平可以較好的將兩種無癥狀感染者區(qū)分開（Fig 5.d-f），幫助臨床中早期識別出潛伏期無癥狀感染者，從而對患者進(jìn)行及時(shí)干預(yù)，改變病程轉(zhuǎn)歸，減輕疾病嚴(yán)重程度，進(jìn)一步降低死亡率。

Fig.5?區(qū)分分離SSIS期的免疫標(biāo)記

總而言之，該研究聚焦目前廣受關(guān)注的新冠無癥狀感染問題，通過對SSIS隊(duì)列的研究，發(fā)現(xiàn)相較于持續(xù)無癥狀感染者，潛伏期無癥狀感染者外周免疫細(xì)胞中CD107alow經(jīng)典型單核細(xì)胞、過渡型單核細(xì)胞、非經(jīng)典型單核細(xì)胞以及CD62Lhi CD8+ Tna?ve細(xì)胞比例均下降，并且血漿蛋白中STC1也是減少的，而 CD4+ NKT細(xì)胞比例是上升的；進(jìn)一步分析后還發(fā)現(xiàn)潛伏期無癥狀感染者存在單核細(xì)胞過度活化和分化抑制的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象可能與淋巴細(xì)胞耗竭和免疫阻滯相關(guān)，揭示了導(dǎo)致SSIS兩種截然不同的進(jìn)展方向的免疫機(jī)制，有助于進(jìn)一步了解SARS-CoV-2感染引起的免疫特征，為臨床工作中早期識別出潛伏期無癥狀感染者，以及在更早的階段對其進(jìn)行及時(shí)干預(yù)并阻斷其進(jìn)展為確診患者提供理論依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

Yu S, et al. Distinct immune signatures discriminate between asymptomatic and presymptomatic SARS-CoV-2pos subjects. Cell Res. 2021.

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00562-1