1. Study design and single-cell RNA pro!ling of PBMCs.
作者對采集了3例正常對照和7例川崎病患者給予IVIG治療前后的外周血，提取PBMC進行了單細胞+TCR BCR 測序。質控之后得到84986細胞，before IVIG: 34073, after IVIG: 36225, health: 14688。
注釋得到的細胞群：
T cells: CD3D, CD3E, CD3G (60.00%)
CD4+ T : CD4 (36.94%), CD8+ T: CD8A, CD8B (18.53%)
NK cells: NCAM1 or CD56, KLRB1, NKG7 (5.44%)
B cells: CD19, MS4A1 or CD20, CD38 (22.27%)
monocytes: CD14, CD68, FCGR3A or CD16 (9.60%)
mDCs: CD1C (0.26%)
pDCs: LILRA4 (0.18%)
HSPCs (hematopoietic stem and progenitor cells): CD34 (0.12%)
erythrocytes: HBB (0.99%)
megakaryocytes: PPBP (0.92%)
組間比較結果顯示：和既往報道相符，治療前的KD患者單核細胞和B細胞比例增加，T細胞和NK細胞比例下降。
作者還把這個數(shù)據(jù)集和一個已發(fā)表的bulk 基因表達數(shù)據(jù)集GSE73577（使用cDNA microarray檢測了19個KD患者給予IVIG治療前后的PBMC），所有基因的fold change在兩組數(shù)據(jù)中呈明顯的正相關 (Pearson’s R = 0.34, P < 2.2 × 10-16)。兩個數(shù)據(jù)中1054個差異表達基因的相關性更強 (Pearson’s R = 0.74, P < 2.2 × 10-16)。提示兩個數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)存在著相似的基因表達模式。
這個圖是這么做的
通過把同一樣本所有細胞的UMI counts直接相加，把scRNAseq的矩陣轉化為行為基因，列為樣品的bulk RNAseq的矩陣，然后使用DESeq2計算給予IVIG前后基因的fold change。
再和GSE73577中測的基因的fold change做相關性分析。
2. Dynamics of major PBMC immune cell types.
Fig 2A：隨后作者比較了不同細胞群治療前后的比例變化。KD患者外周血B細胞和正常相比出現(xiàn)明顯上升，IVIG治療后下降至正常。IVIG治療后CD4T細胞比例上升。和正常相比，KD患者的CD8T細胞比例下降，治療后出現(xiàn)回升。KD患者的NK細胞比例也出現(xiàn)下降。
Fig 2B：流式結果和單細胞的結果一致。
Fig 2C：既往文獻報道IVIG治療后外周血單核細胞比例會下降，但是P1患者在治療后出現(xiàn)了上升。為了排除潛在的技術偏差，作者找到了患者血常規(guī)的數(shù)據(jù)，和單細胞的數(shù)據(jù)是一致的。
3. Monocyte subsets and responses
Fig 3A： 把單核細胞進一步分為了CD14單核和CD16單核。盡管正常和治療前的PBMC中CD16沒有明顯差別，IVIG治療后CD16單核的比例顯著下降。
Fig 3B： 隨后作者做了單核細胞的差異分析，展示了一部分差異基因。治療前的KD患者出現(xiàn)了S100蛋白，免疫球蛋白受體，細胞因子受體，補體受體的上調和MHC II受體的下調。細胞因子的表達異質性比較大，一些細胞因子包括IFNAR2, IFNGR2, IL3RA, IL10RB和CX3CR1在治療前的患者中表達比較高，一些細胞因子如IL7R, IL13RA1, IL6ST, 和CXCR3則在治療后和正?；颊咧斜磉_比較高。
Fig 3C：高細胞因子血癥是KD的一個重要特征，作者查看了一些細胞因子在不同細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)它們主要來自于單核細胞。IL1B和TNF這兩個在KD中比較重要的細胞因子也在單核細胞中比較高。
Fig 3D：IL1B和TNF主要是在治療前的KD患者外周血比較高
4. B-cell subsets and BCR repertoires.
這部分分析了B細胞，將外周血B細胞細分為了4個亞群
Bn: MS4A1, TCL1A (62.73%)
Bm: MS4A1, CD27, IGHA1, IGHG1 (17.27%)
plasma cells: CD27, CD38, IGHA1, IGHG1 (6.24%)
intermediate between naive and memory cells (13.77%)
Fig 4A B：IVIG治療后，漿細胞的比例上升，這個結果在20HC和16KD患者的外周血數(shù)據(jù)中也做了流式驗證，結果一致。
Fig 4C：B細胞的差異基因。治療前的樣品出現(xiàn)了一些細胞周期相關基因的上調（比如CCND2, RRM2, CENPM, NME1, CKS1B和MYC）和抑制細胞周期相關基因的下調（BTG2和CDKN1B）。這個現(xiàn)象和前面Fig 2中B細胞比例增加相一致。
Fig 4D：IGHA和IGHG在IVIG治療后出現(xiàn)了明顯上調。提示存在從IgM/IgD到IgG/IgA的表型轉變。
Fig 4E：BCR的分析結果提示多數(shù)病人（除了P7）的BCR克隆在治療后都出現(xiàn)明顯增加。而且存在著單克隆擴增，尤其是IgA和IgG isotype。擴增克隆的IGHV基因usage在不同病人間存在異質性，在KD患者和HC中也沒有明顯差異。提示specific B-cell reactions而不是responses to a superantigen。
5. T- and NK-cell subsets and TCR repertoires.
對CD4+T, CD8+T和NK細胞做了亞群細分。CD4+T和CD8+T都分出了三個亞群：
naive cells: CCR7, SELL (70.41%)
central memory cells: 共表達CCR7, SELL和S100A4 (12.04%)
effector memory cells: S100A4 (6.54%)
CD8+Tm還高表達細胞毒性相關基因：GZMK和GZMB
此外還鑒定出了：
CD4^+^Treg: FOXP3 (3.51%)
γδ T cells: TRDC (5.34%)
proliferating T cells: TYMS (2.15%)
Fig 5A B：和HC相比，KD患者外周血CD8+Tn顯著增加，CD8+Tem顯著減少。流式驗證了這個結果。提示外周血CD8+T的下降主要是具有殺傷效應的CD8+Tem的下降。
Fig 5C D：分開CD4和CD8計算了差異基因和功能富集，兩類細胞表達模式基本相似。
Fig 5E：挑了個感興趣的基因看了表達變化
Fig 5F：TCR的分析
