今天學(xué)習(xí)內(nèi)容是測序。學(xué)習(xí)資料主要來源：微信公眾號生信星球
一、一二三代測序 [1] [2] [3]
思維導(dǎo)圖對測序的原理、優(yōu)缺點進行了簡短的總結(jié)，各項技術(shù)參數(shù)的對比如下，本文正文部分主要對測序原理進行梳理。
圖源網(wǎng)絡(luò)
1. 一代測序原理
DNA雙脫氧鏈終止法：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)。在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（ddATP,ddCTP,ddGTP和 ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。
一代測序原理
2. 二代測序原理
第二代測序技術(shù)：Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的 Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)，此處主要介紹illumina公司的測序原理。
Illumina
這部分內(nèi)容可以看b站【陳巍學(xué)基因】視頻1 ，講得非常清楚。
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DNA待測文庫構(gòu)建
利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成200-500bp長的小片段，然后通過末端修復(fù)、磷酸化、加A等步驟修補成平末端，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。 -
Flowcell
Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，建庫完成后，文庫中的DNA在通過 flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭（共價結(jié)合），這些接頭能和加在DNA片段兩端的接頭相互配對，DNA后續(xù)在其表面進行橋式PCR擴增。 -
橋式pcr擴增
Flowcel上面連有兩種接頭（P5、P7），當DNA經(jīng)變性后流經(jīng)Flowcell時，利用Flowcell上的接頭與DNA兩端的接頭相互匹配。DNA進行橋式PCR擴增，從而將堿基信號放大。通過橋式PCR不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。 -
測序
邊合成邊測序。向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有特異熒光標記的4種dNTP。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄， 最后利用計算機分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應(yīng)。 - 數(shù)據(jù)產(chǎn)出
3. 三代測序原理
SMRT技術(shù)
邊合成邊測序，以SMRT芯片為測序載體，芯片上眾多小孔中的DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標記4種堿基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在堿基配對階段，加入不同堿基會發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。另外，若堿基存在修飾，則通過聚合酶的速度會減慢，因此可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間、兩峰之間的距離來檢測甲基化等堿基修飾情況。
納米孔單分子測序技術(shù)
當在膜兩側(cè)施加電壓，分子馬達驅(qū)動DNA分子通過納米孔，導(dǎo)致電荷發(fā)生變化，每種堿基引起的電流變化是不同的，通過檢測這些電流進而轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的堿基序列。
二、組學(xué)的相關(guān)名詞及應(yīng)用[4]
詳見思維導(dǎo)圖，重點學(xué)了一下基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)（因為是我的方向·ω·）
三、測序的發(fā)展史[5]
測序發(fā)展史，圖源網(wǎng)絡(luò)
Day7思維導(dǎo)圖
參考文章：
