1. PCR：（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是通過PCR儀，模擬DNA半保留復(fù)制，從而體外快速擴(kuò)增DNA的方式。

一、基本過程

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)步驟，通過將這一套過程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬倍的擴(kuò)增。
因此所謂的PCR儀，其實(shí)就是一套自動溫控系統(tǒng)

1. 高溫變性：95℃左右時(shí)DNA雙鏈打開的過程，使之能夠與引物結(jié)合，為下面的反應(yīng)做準(zhǔn)備。這個(gè)過程大約需要5 min左右。

2. 低溫退火：就是適宜條件下冷卻的過程，變性后的單鏈與引物通過堿基互補(bǔ)配對，再次形成局部雙鏈。更準(zhǔn)確的來講應(yīng)該叫復(fù)性，恢復(fù)雙鏈的過程。

3. 中溫延伸：模板-引物接頭之后，延伸就是在72℃、TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，以靶向序列為模板，堿基互補(bǔ)配對為原則，再次合成完整的雙鏈DNA的過程。

我們可以看到這里復(fù)制之后實(shí)際上有一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模硪粭l則是原先就存在的，因此說這叫半保留復(fù)制。

二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的組成成分

1.模板（1 ng/μL）
模板DNA可以從各種生物組織中得到，通常濃度為1 ng/μL。濃度不是越高越好，濃度太高會導(dǎo)致大量的非特異性結(jié)合。

2.引物（10 μmol/L）
引物濃度通常是10 μmol/L。
引物濃度太低，產(chǎn)量較低；
引物濃度太高，引起錯(cuò)配、非特異性以及引物二聚體。

3.Taq酶（5 U/μL）
U是酶活力單位，定義為：25℃下（其它為最適條件），1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶含量，或是轉(zhuǎn)化底物中1 μmol有關(guān)基團(tuán)的酶含量。

4.dNTP（2.5 mmol/L）
dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，從而影響DNA聚合酶的活性。

5.Buffer（含Mg2+）
Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。
Mg2+濃度過低會使DNA聚合酶活性降低，PCR產(chǎn)量下降。
Mg2+濃度過高會使特異性降低。

三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系

四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果

對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測

2. 醫(yī)院送檢樣品熒光PCR的流感檢測

一、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

Real-time qPCR是指在PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強(qiáng)弱的變化，即時(shí)分析目的基因的初始量，該技術(shù)的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。

目前根據(jù)Real-time qPCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)不同，將其分為熒光染料和熒光探針兩類。

1. 熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

2. Real-time qPCR中最常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
   正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上，探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。
   當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。
   TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題，反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

二、流感標(biāo)本檢測流程

1. 分裝病毒

保存于進(jìn)口EP管，300u 一個(gè)
封裝前充分震蕩保存液

2. 機(jī)提核酸

• 準(zhǔn)備深96孔板、試劑盒、樣品300u、陽性對照（fluA、fluB）
• 96孔板中加入：
  第一列：裂解液300u、PK10u、AC4u、磁珠10u、樣本（最后加）
  第二列：Wash Buffer Ⅰ 500u （用前混勻）
  第三列：Wash Buffer Ⅱ 500u
  第四列：Wash Buffer Ⅲ 550u
  第五列：空
  第六列：Elution B 30u
• 最后先加樣品，后加陽性對照；移液槍吹吸混勻。
• 充分反應(yīng)10分鐘后，上機(jī)器

3. 準(zhǔn)備體系：25u

要分別準(zhǔn)備fluA和fluB的體系

• T： 5u
• 5×buffer : 稀釋至1×，也就是 5u
• dNTP：1u
• 引物 F: 0.2u；R:0.2u
• probe：0.2u （現(xiàn)配現(xiàn)用，母液1：10稀釋）
• E ：1u
• 水：剩余的：12.4u

4. 上機(jī)

• 將提取出的核酸與此前配好的體系分裝入八連管中
• 注意：不要有氣泡

3. 流式細(xì)胞術(shù)

一、基本概念

流式細(xì)胞儀，樣品細(xì)胞和熒光染料是流式細(xì)胞術(shù)的三大要素
流式細(xì)胞術(shù)檢測的對象是呈獨(dú)立狀態(tài)懸浮于液體中的細(xì)胞，不能直接檢測組織塊中的細(xì)胞，必須先用各種方法將臟器或者組織制備成為單細(xì)胞懸液，然后標(biāo)記上熒光素偶聯(lián)抗體，才能夠被流式細(xì)胞儀檢測。
流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域極其廣泛，特別是免疫學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)［3-6］，現(xiàn)在流式細(xì)胞術(shù)還能夠輔助多種疾病的這段，尤其是白血病的診斷和分型。

二、流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀是對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來。

三、流式細(xì)胞儀的基本組成

各種型號的流式細(xì)胞儀雖然差別較大，但是基本結(jié)構(gòu)是相同的，一般分為:液流系統(tǒng)，光路系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和分選系統(tǒng)［7］。分析型流式細(xì)胞儀主要由前面的三個(gè)系統(tǒng)組成，分選型流式細(xì)胞儀比分析型細(xì)胞儀多了一個(gè)分選系統(tǒng)。

1.液流系統(tǒng)

液流系統(tǒng)由兩套緊密聯(lián)系而又相互獨(dú)立的液流組成，即鞘液流和樣品流。鞘液流從鞘液筒開始，通過管道進(jìn)入噴嘴，經(jīng)噴嘴的小孔形成穩(wěn)定的可見的液流。鞘液最基本的特征就是等滲，保證處于鞘液中的細(xì)胞不會因?yàn)榈蜐B或者高滲而死亡。樣品流是上樣分析的含有樣品細(xì)胞的液體流，樣品流開始于樣品管，經(jīng)過特定的專門管道進(jìn)入噴嘴，然后與鞘液一起從噴嘴口射出形成可見液流，最后經(jīng)過廢液孔流入廢液桶。上樣分析時(shí)，兩種液體雖然互相接觸，卻沒有互相混合在一起，而是形成層流，樣品流在中間，鞘液流在外圍，而且兩者所受的壓力也不一樣。操作者可以通過調(diào)節(jié)樣品正壓和鞘液正壓之差來控制上樣的速度，樣品的正壓和鞘液正壓之差越大，可見液流中樣品流的直徑就越大。上樣分析的速度就越大。

2.光路系統(tǒng)

光路系統(tǒng)開始于激光器，激光器是流式細(xì)胞儀的必需組成元件之一，不同的激光器發(fā)出的激光照射到細(xì)胞之后產(chǎn)生的光信號會經(jīng)過不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收，流式細(xì)胞儀需要通過光路系統(tǒng)，根據(jù)不同的接收通道接收，然后通過信號的強(qiáng)弱間接反映細(xì)胞的物理化學(xué)特性。

光路系統(tǒng)是由一系列的透鏡，濾光片和小孔組成，根據(jù)波長的不同分離各種光信號，其中濾光片尤其重要。根據(jù)功能的不同，可以分為長通濾片，短通濾片和帶通濾片三種。長通濾片功能為:波長大于特定波長的光可以通過，波長小于該波長的光被反射。短通濾片的波長小于特定波長的光可以通過，波長大于該波長的光被反射。帶通濾片的功能為:波長在某特定范圍的光可以通過，波長在該范圍以外的光被反射。

488nm激光側(cè)面接收光光信號分離示意圖

利用不同的類型的濾光片，將混合光信號分為六個(gè)不同的光信號，進(jìn)入不同的六個(gè)通道，分別為SSC通道，F(xiàn)IFC通道，PE通道，PE-TxRed通道，PE-Cy5通道和PE-Cy7通道。

3.檢測分析系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的檢測分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細(xì)胞的各個(gè)通道的光信號匯總分析，最后得出的樣品群體中細(xì)胞的物理化學(xué)特征。這里必須提到光電倍增管的概念。通過濾光片根據(jù)波長的不同分離的光信號最后進(jìn)入各自呢通道，也就是各自的光電倍增管。光電倍增管的功能主要為:將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，同時(shí)通過一定的比例將信號放大。

流式細(xì)胞儀的通道根據(jù)光信號性質(zhì)的不同可以分為散射光和熒光通道。散射光通道是接收散射光的通道，即前向角散射光（FSC）通道和側(cè)向角散射光（SSC）通道。熒光通道的命名方式是該通道主要接收哪個(gè)熒光素的熒光，就根據(jù)該熒光素的名稱來命名。例如FITC通道，接收488nm激光激發(fā)后的熒光信號，波長510-550nm的熒光信號，所以，當(dāng)細(xì)胞被超級FITC偶聯(lián)抗體時(shí)，該通道所代表的信號就是FITC的信號，該通道接收的熒光信號越強(qiáng)，表示細(xì)胞上結(jié)合的FITC熒光素越多，為了方便，該通道被命名為FITC通道。此外，以主要熒光素命名的通道并不是只接收這一種熒光素被激發(fā)的熒光信號，其他的熒光素被激發(fā)后的熒光信號也可以被通道所接收和分析，如FITC通道，它也可以接收GFP和CFSE被488nm激光激發(fā)以后的熒光信號。

散射光信號和熒光信號經(jīng)過光電倍增轉(zhuǎn)為電子信號后，是以電子脈沖和電子波的形式被計(jì)算機(jī)系統(tǒng)接收和分析的。電子波的比較大小主要有三種方式，即電子波的長度，寬度和面積。這三個(gè)參數(shù)都可以反映光信號的大小，但是參數(shù)面積代表電子波的大小要比長度和寬度更加準(zhǔn)確。

流式通道的A，H和W的意義

4.分選系統(tǒng)

分選式流式細(xì)胞儀比分析型流式細(xì)胞儀多一個(gè)系統(tǒng)，流式分選系統(tǒng)。分選型流式細(xì)胞儀能夠從樣品細(xì)胞中分離出目標(biāo)細(xì)胞，回收后可以再培養(yǎng)，即，分選之后的細(xì)胞是具有活性的，無菌條件下的細(xì)胞。

四、流式分析的應(yīng)用

1.免疫表型分析的應(yīng)用

檢測淋巴細(xì)胞亞群，監(jiān)測細(xì)胞免疫狀態(tài)(淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能重要的大細(xì)胞群，在免疫應(yīng)答過程中，末梢血淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成為功能不同的亞群。當(dāng)亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，就能導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化［10-11］。FCM可以同時(shí)檢測一種或幾種淋巴細(xì)胞表面抗原，將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開來，并計(jì)算出它們相互間的比例，通過對病人淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，并指導(dǎo)治療)。

2. DNA含量及細(xì)胞周期分析

細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個(gè)時(shí)期，DNA的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)出周期性的變化［12］。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，對細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.應(yīng)用于：腫瘤的早期診斷、腫瘤的良惡性判斷、觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及周期分布和療效監(jiān)測。

3.定量分析

檢測細(xì)胞特異性標(biāo)記物：FCM不但可以定性分析標(biāo)記物，而且可以進(jìn)行定量。用標(biāo)記已知數(shù)量的熒光素分子的標(biāo)準(zhǔn)微球作參照，可以計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞抗原定簇的個(gè)數(shù)。