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Basic Information

• 英文標(biāo)題： Macrophage-mediated myelin recycling fuels brain cancer malignancy
• 中文標(biāo)題：巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的髓鞘回收為腦癌惡性提供燃料
• 發(fā)表日期：19 September 2024
• 文章類型：Article
• 所屬期刊：Cell
• 文章作者：Daan J. Kloosterman | Leila Akkari
• 文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424008249

Highlights

Para_01

• TAMs 回收富含膽固醇的髓鞘，并在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中獲得富含脂質(zhì)的特征
• 由髓鞘碎片清除引起的表觀遺傳重編程是LLM免疫抑制特征的基礎(chǔ)
• LLMs 將髓鞘來源的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，以促進(jìn)疾病進(jìn)展
• LLMs與患者侵襲性間質(zhì)亞型和不良預(yù)后相關(guān)

Summary

Para_01

1. 在代謝受挑戰(zhàn)的環(huán)境中生長的腫瘤，如大腦中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，特別依賴與腫瘤微環(huán)境（TME）的相互作用來滿足其高能量需求。
2. 為了研究這種代謝相互作用的復(fù)雜性，我們使用單細(xì)胞和多組學(xué)分析來研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME的異質(zhì)性，并識(shí)別出具有促腫瘤生成特性的代謝重編程腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）亞群。
3. 這些TAM亞群，被命名為脂質(zhì)負(fù)荷巨噬細(xì)胞（LLMs），以反映其膽固醇積累，經(jīng)歷了表觀遺傳重編程，表現(xiàn)出免疫抑制特征，并且在侵襲性間充質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型中富集。
4. 吞噬富含膽固醇的髓鞘碎片使得TAM的某些亞群獲得LLM表型。
5. 隨后，LLMs通過LXR/Abca1依賴性方式直接將髓鞘來源的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞，從而為間充質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的高代謝需求提供燃料。
6. 我們的工作深入了解了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展過程中的免疫代謝相互作用，從而為揭示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可靶向的代謝脆弱性奠定了基礎(chǔ)。

Graphical abstract

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Keywords

• glioblastoma; macrophages; cholesterol; myelin recycling; lipid metabolism; cancer immunity; tumor microenvironment

Introduction

Para_01

1. 大腦中發(fā)生的腫瘤受益于獨(dú)特的微環(huán)境，這一環(huán)境隨著惡性特征的擴(kuò)展而被動(dòng)態(tài)利用。
2. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最具侵略性的原發(fā)性腦腫瘤，它是一種無法治愈的疾病，預(yù)后糟糕，并且在腫瘤亞型、微環(huán)境生態(tài)位和免疫景觀方面表現(xiàn)出高度異質(zhì)性。
3. 除了再現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育層次結(jié)構(gòu)外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型還具有影響巨噬細(xì)胞極化的不同代謝特征。
4. 由于巨噬細(xì)胞在膠質(zhì)瘤生成和治療反應(yīng)中起著重要作用，這些細(xì)胞已被探索為有潛力的治療靶點(diǎn)。
5. 然而，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤所表現(xiàn)出的高腫瘤內(nèi)和患者間異質(zhì)性挑戰(zhàn)了針對(duì)腦癌的泛巨噬細(xì)胞"一刀切"的治療方法，這要求深入理解它們的巨大可塑性。

Para_02

1. 確實(shí)，巨噬細(xì)胞是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤微環(huán)境（TME）中最豐富的免疫細(xì)胞，并且在發(fā)生學(xué)上是多樣的，包括駐留在大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）和浸潤的單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（MDMs）。
2. 盡管最近的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析報(bào)告稱，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的亞群可以預(yù)測生存或表現(xiàn)出改變的代謝特征，但支撐膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TAM多樣性和功能的分子基礎(chǔ)仍然知之甚少。

Para_03

1. 在這項(xiàng)研究中，我們采用多組學(xué)方法來解析TAM亞群的異質(zhì)性和空間多樣性，揭示它們與不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型之間的特定生態(tài)位相互作用，以及它們在放療（RT）后疾病復(fù)發(fā)中的影響。
2. 通過使用互補(bǔ)的模型系統(tǒng)和功能分析，我們發(fā)現(xiàn)TAM介導(dǎo)的機(jī)制允許膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞克服代謝自主型腦環(huán)境所特有的挑戰(zhàn)。
3. 我們表明，脂質(zhì)在呈現(xiàn)脂質(zhì)負(fù)荷表型的間充質(zhì)樣（MES樣）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞和TAM亞群之間的代謝相互作用中扮演著中心角色。
4. 隨著TAM不斷發(fā)展，獲得這種重新連接的代謝教育，它們獲得了增強(qiáng)的促腫瘤發(fā)生和免疫抑制特性，從而加劇了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性。
5. 我們的研究深入揭示了TME中TAM亞群特化的機(jī)制，并確定TAM代謝重編程是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可以利用的治療脆弱性。

Results

Murine glioblastoma displays dynamic cellular subtype heterogeneity in response to RT

小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)放療表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的細(xì)胞亞型異質(zhì)性反應(yīng)

Para_01

1. 為了揭示巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用的惡性膠質(zhì)瘤，我們研究了兩個(gè)基因工程小鼠模型（GEMMs）的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組水平上的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)模型再現(xiàn)了人類膠質(zhì)瘤發(fā)生和治療反應(yīng)的關(guān)鍵特征。
2. 這兩種GEMMs涉及在內(nèi)皮素陽性祖細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)血小板衍生生長因子-β，背景為Ink4a/ArfKO（PDG-Ink4a）或與腫瘤細(xì)胞中短發(fā)夾介導(dǎo)的p53敲低相結(jié)合（PDG-p53）。
3. 正交地，公開可用的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者數(shù)據(jù)集使我們能夠驗(yàn)證我們小鼠模型的臨床相關(guān)性。
4. 我們探討了與局部微環(huán)境相關(guān)的巨噬細(xì)胞亞群異質(zhì)性，采用多組學(xué)方法和一系列功能性的ex vivo和in vitro實(shí)驗(yàn)，以揭示在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME中巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共進(jìn)化下的促腫瘤相互作用（圖1A）。

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• 圖 1. 單細(xì)胞分析揭示了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤間充質(zhì)亞型和GPNMBhigh TAMs的同時(shí)存在（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖，用于評(píng)估巨噬細(xì)胞亞群和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型/生態(tài)位異質(zhì)性和使用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GEMM和公共數(shù)據(jù)集的相互作用（見STAR方法）。（B）來自scRNA-seq膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠數(shù)據(jù)集的主要細(xì)胞群體的均勻流形近似和投影（UMAP）表示（DCs，樹突狀細(xì)胞；ECs，內(nèi)皮細(xì)胞）。（C）scRNA-seq進(jìn)行的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型異質(zhì)性的視覺表示。（D）每個(gè)模型中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型的平均分?jǐn)?shù)（外圈）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（內(nèi)圈）的偽定位2分配顯示為細(xì)胞亞型的百分比。
• （E）MG和MDM亞群的UMAP表示。（F）在（E）中確定的MG和MDM群中描繪的通路的基因集富集分析（GSEA）得分。（G）（E）中確定的簇的TAM亞群的偽定位生態(tài)位分配；表示為平均值±SEM。（H）左中和中間：在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中復(fù)發(fā)時(shí)TAM亞群的不同豐度。右：TAM亞群與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型豐度之間的相關(guān)性矩陣。
• （I）GPNMBhigh和GPNMBlow TAM簇之間差異表達(dá)的前25個(gè)基因（表S1C）。（J）在小鼠和人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，GPNMBhigh TAMs與MES膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞之間的相關(guān)性。
• 統(tǒng)計(jì)：Kendall趨勢檢驗(yàn)（H）或簡單線性回歸（J）（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）。P2RY12，嘌呤能受體P2Y12；TNF，腫瘤壞死因子；GPNMB，糖蛋白Nmb；CCR2，C-C趨化因子受體2型；H2-EB1，組織相容性2，II類抗原E Beta。另見圖S1和表S1。與圖1和2、表S2相關(guān)的單細(xì)胞RNA測序和VISIUM10x數(shù)據(jù)集的計(jì)算機(jī)分析相關(guān)基因簽名。與圖1、表S3相關(guān)的巨噬細(xì)胞亞群基因集過表達(dá)分析。GPNMB的基因集過表達(dá)分析。

Para_01

1. 單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)顯示，來自原始(未經(jīng)治療)和復(fù)發(fā)性(在5×2 Gy分割放療后復(fù)發(fā))腫瘤的CD45+和CD45?熒光激活細(xì)胞分選(FACS)純化細(xì)胞，在兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GEMM模型中均突顯了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME的細(xì)胞異質(zhì)性(圖1B)。為了了解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)巨噬細(xì)胞教育的影響，我們首先根據(jù)之前在單細(xì)胞水平上報(bào)道的特定轉(zhuǎn)錄特征，將腫瘤細(xì)胞分為與不同分子亞型相關(guān)的分子亞型。
2. 在患者中，這些細(xì)胞亞型——類神經(jīng)祖細(xì)胞樣(NPC-like)、類少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞樣(OPC-like)、類星形膠質(zhì)細(xì)胞樣(AC-like)和MES樣——在每個(gè)個(gè)體腫瘤中均有表達(dá)，這種異質(zhì)性在小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中得到了再現(xiàn)(圖1C)。
3. 我們使用了Ivy膠質(zhì)母細(xì)胞瘤圖譜項(xiàng)目(GAP)數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集定義了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤主要解剖特征的niche-specific轉(zhuǎn)錄特征(LE，前沿；CT，細(xì)胞腫瘤；MVP，微血管增殖；PAN，偽柵欄細(xì)胞圍繞壞死)，將單個(gè)腫瘤細(xì)胞分配到一個(gè)偽空間位置，并發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型在這些niche中異質(zhì)分布(圖1D)。

Para_02

1. 接下來，我們分析了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中癌細(xì)胞腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，并探討在放療后的復(fù)發(fā)疾病中，是否如人類腫瘤中所見，發(fā)生了亞型轉(zhuǎn)變。
2. PDG-p53模型表現(xiàn)出主要的AC樣原發(fā)腫瘤，而在復(fù)發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)镺PC樣主導(dǎo)組成，盡管存在高腫瘤間變異性（圖1D）。
3. 與之不同的是，以O(shè)PC樣腫瘤細(xì)胞為主導(dǎo)群體的PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在復(fù)發(fā)時(shí)預(yù)測性地向更富含MES表型的方向轉(zhuǎn)變（圖1D）。
4. 總的來說，這些結(jié)果顯示異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)的癌細(xì)胞亞型變化在小鼠PDG驅(qū)動(dòng)的腫瘤中以階段和生態(tài)位依賴的方式發(fā)生，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的報(bào)道結(jié)果相呼應(yīng)。

Macrophage subset dynamics correlate with glioblastoma stage, cellular subtype composition, and local niches

巨噬細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤階段、細(xì)胞亞型組成和局部生態(tài)位相關(guān)

Para_01

1. 我們接下來探索了癌癥細(xì)胞亞型動(dòng)態(tài)與巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的異型相互作用。
2. 無監(jiān)督聚類分析將MDM和MG細(xì)胞分成了8種狀態(tài)，包括4種MG和4種MDM亞群（圖1E和S1A）。
3. 我們檢查了這些不同TAM身份的轉(zhuǎn)錄表型與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微解剖生態(tài)位、疾病階段和分子亞型的關(guān)系。
4. 在兩種TAM亞群中，我們觀察到了從預(yù)先激活（MG1-P2RY12和MDM1-CCR2）到炎癥（MG2-TNF和MDM2-H2-EB1）、代謝活躍（MG3-GPNMB和MDM3-GPNMB）以及增殖狀態(tài)（MG4-MKI67和MDM4-MKI67）的表型譜（圖1F和S1B-S1D；表S1A、S1B和S2A-S2H）。
5. 與之前報(bào)道的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME中MDM含量增加一致，復(fù)發(fā)性腫瘤中MDM4-MKI67的豐度顯著增加，且MG4-MKI67和MDM4-MKI67群都與MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存在呈正相關(guān)（圖1H）。
6. 時(shí)間戳轉(zhuǎn)錄特征揭示了從MDM1到MDM3的48小時(shí)時(shí)間戳逐漸富集，這表明了MDM中發(fā)生了一種分化軌跡，而不是TME中亞群的擴(kuò)張（圖S1E）。

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• 圖S1：對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中巨噬細(xì)胞景觀的深入轉(zhuǎn)錄組分析，與圖1相關(guān)（A）堆積小提琴圖描繪了在圖1B和1E中展示的MG和MDM群體（52,688個(gè)細(xì)胞）中定義MG1-4和MDM1-4簇的代表基因的表達(dá)；表S1A。所有PDG-Ink4a原發(fā)（n=3）和復(fù)發(fā)（n=3）以及PDG-p53原發(fā)（n=4）和復(fù)發(fā)（n=3）腫瘤樣本中的MG和MDM均有代表。
• 顏色與圖1E中呈現(xiàn)的細(xì)胞簇相對(duì)應(yīng)。（B）熱圖顯示從GSEA獲得的與每個(gè)巨噬細(xì)胞簇相關(guān)的已發(fā)表特征的平均富集分?jǐn)?shù)，數(shù)據(jù)按列在1和0之間縮放。顯示的特征來自表S1B中引用的已發(fā)表研究。
• （C和D）條形圖描繪了每個(gè)MG（C）和MDM（D）簇特有的相關(guān)通路的調(diào)整后p值。結(jié)果是通過 對(duì)每個(gè)簇的前30個(gè)顯著差異表達(dá)基因（padjusted<0.05）進(jìn)行基因集富集分析產(chǎn)生的（見表S2）。
• （E）線圖描繪了每個(gè)MDM簇中12小時(shí)和48小時(shí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤MDM時(shí)間戳模塊的平均富集分?jǐn)?shù)。（F）餅圖表示每個(gè)MG亞群占健康腦中總巨噬細(xì)胞百分比，通過scRNA-seq捕獲。
• （G）條形圖顯示了與GPNMBlow或GPNMBhigh簇中增加的前30個(gè)差異表達(dá)基因相關(guān)的顯著富集通路的調(diào)整后p值（表S3）。統(tǒng)計(jì)方法：Fisher精確檢驗(yàn)與Benjamini-Hochberg方法結(jié)合，用于多假設(shè)檢驗(yàn)的校正。
• （H）小提琴圖顯示了每個(gè)MG和MDM簇的GPNMBhigh特征富集分?jǐn)?shù)，顯示了每個(gè)簇中分配為GPNMBhigh的巨噬細(xì)胞百分比。（I）餅圖表示通過scRNA-seq對(duì)所有測序腫瘤中定義為GPNMBhigh TAMs的巨噬細(xì)胞亞群組成。
• （J）散點(diǎn)圖描繪了T細(xì)胞含量（作為CD45+細(xì)胞的百分比）與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的GPNMBhigh TAMs豐富度（作為總TAMs的百分比）之間的相關(guān)性。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤（n=22）。紅線表示簡單線性回歸。Pearson相關(guān)系數(shù)和p值顯示在右上角。

Para_01

1. 正如預(yù)期的那樣，預(yù)激活的MG1-P2RY12簇，與從健康大腦中FACS純化的MG非常相似，預(yù)計(jì)在腫瘤LE中與其他MG亞群相比會(huì)過度表達(dá)，表明腫瘤從MG起源的大腦實(shí)質(zhì)中侵入（圖1G和S1F）。
2. 同樣，類似預(yù)激活的單核細(xì)胞滲透到腫瘤部位的MDM1-CCR2簇（圖S1A和S1E），預(yù)計(jì)會(huì)在MVP區(qū)域富集，這與外周招募的預(yù)期一致（圖1G）。

Para_02

1. 從這些特定于發(fā)生的簇中，我們鑒定出具有炎癥特征的巨噬細(xì)胞。
2. 在微膠質(zhì)（MG）室中，組成MG2-TNF簇的細(xì)胞同樣具有在神經(jīng)炎癥中報(bào)道的轉(zhuǎn)錄教育，因此高表達(dá)促炎基因（Tnf、Ccl4和Ccl3）和神經(jīng)炎癥反應(yīng)途徑（圖1F、S1B和S1C；表S1B）。
3. 相對(duì)應(yīng)的MDM2-H2-EB1簇也表現(xiàn)出了炎癥反應(yīng)基因表達(dá)的增加，盡管性質(zhì)不同，并且通過增加抗原處理特征（H2-Eb1、H2-Aa和Cd74）區(qū)分開來（圖S1B和S1D；表S1A）。
4. 有趣的是，MG2-TNF和MDM2-H2-EB1巨噬細(xì)胞簇與MES2細(xì)胞亞型呈負(fù)相關(guān)（圖1H），表明富含MES的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤總體上表現(xiàn)出較低的炎癥性TAMs，這與患者中它們的侵略性表型一致。

Para_03

1. MDM3-GPNMB 簇位于 MG 和 MDM 聚集以及 MDM 分化軌跡的頂端（圖 1E 和 S1E），在 MES 富集的 PDG-Ink4a 復(fù)發(fā)腫瘤中特異性增加（圖 1H）。
2. 與 MG3-GPNMB 細(xì)胞一起，這兩個(gè)簇主要被預(yù)測位于 PAN（低氧）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生態(tài)位中，MES2 腫瘤細(xì)胞偏好居住在這里（圖 1D 和 1G）。
3. 功能上，來自 MDM3-GPNMB 和 MG3-GPNMB 簇的巨噬細(xì)胞具有與"脂質(zhì)相關(guān)"巨噬細(xì)胞相似的轉(zhuǎn)錄教育（圖 S1B；表 S2C 和 S2G）。
4. 有趣的是，這些巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與之前在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型和患者樣本中具有脂質(zhì)/吞噬教育或具有促腫瘤生成的免疫抑制功能的 TAM 相似。
5. 相比之下，這些簇表現(xiàn)出所有 TAM 亞群中最低的炎癥表型，同時(shí)呈現(xiàn)細(xì)胞通路活化增加，這些通路涉及泡沫細(xì)胞分化（圖 1F）。
6. 因此，這些無偏分析突顯了 MDM3-GPNMB 和 MG3-GPNMB TAM 亞群可能的脂質(zhì)相關(guān)或脂質(zhì)負(fù)荷表型。
7. 雖然脂質(zhì)負(fù)荷巨噬細(xì)胞（LLMs）之前在肥胖或動(dòng)脈粥樣硬化的背景下觀察到，最近在一小部分癌癥中作為一種促腫瘤生成的 TAM 亞群出現(xiàn)，但它們在大腦中的存在僅在有衰老和神經(jīng)退行性疾病的過程中有報(bào)道。
8. 總的來說，我們的發(fā)現(xiàn)表明，與 LLMs 轉(zhuǎn)錄相似的 GPNMBhigh TAMs 在 MES 富集的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中增加，隨著 PDG-Ink4a 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在復(fù)發(fā)性疾病中轉(zhuǎn)向這種亞型，并與低氧微解剖生態(tài)位中的 MES 樣癌細(xì)胞相關(guān)。
9. 假設(shè)這種異型交叉對(duì)話可能會(huì)推動(dòng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展和 OPC 向 MES 的轉(zhuǎn)變，我們試圖進(jìn)一步驗(yàn)證 LLMs 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的存在及其意義。

Para_04

1. 利用區(qū)分MG3-GPNMB和MDM3-GPNMB TAM群落的差異表達(dá)基因，我們生成了一個(gè)GPNMBhigh特征，以可靠地量化呈現(xiàn)與其它疾病中的LLMs相似的轉(zhuǎn)錄表型的TAMs的百分比（圖1I和S1G；表S3A和S3B）。
2. 有趣的是，除了MG3/MDM3群集之外，被歸類為GPNMBhigh的TAMs還包括屬于其他TAM子集的細(xì)胞（圖S1H和S1I）。
3. 與之前的研究一致，相關(guān)分析揭示了MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與GPNMBhigh巨噬細(xì)胞在小鼠和人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的強(qiáng)烈相關(guān)性，不受原發(fā)/復(fù)發(fā)性疾病階段的影響（圖1J）。
4. 正如預(yù)期，從它們的抗炎特性（圖1F）來看，GPNMBhigh巨噬細(xì)胞與患者樣本中的淋巴浸潤呈負(fù)相關(guān)，支持脂質(zhì)負(fù)荷表型的巨噬細(xì)胞在MES富集的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫抑制性中起作用的觀點(diǎn)（圖S1J）。
5. 總的來說，我們的結(jié)果表明GPNMBhigh TAMs通過獲得脂質(zhì)負(fù)荷、抗炎表型并與侵襲性MES樣亞型相關(guān)聯(lián)，具有功能上的重要性。

Spatial co-localization of GPNMBhigh macrophages with MES-like cells in hypoxic niches

GPNMBhigh 巨噬細(xì)胞與 MES-like 細(xì)胞在缺氧生態(tài)位中的空間共定位

Para_01

1. 為了加深我們對(duì)巨噬細(xì)胞亞群與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型之間空間相互作用的了解，我們對(duì)小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織切片進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。
2. 使用代表巨噬細(xì)胞（IBA1）、微血管周細(xì)胞（MVP，CD31）、普遍缺氧標(biāo)記（PAN，缺氧標(biāo)記物pimonidazole）、低密度細(xì)胞（LE，低密度DAPI）和高密度細(xì)胞（CT，高密度DAPI）的免疫熒光（IF）染色，以可視化不同微解剖膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生態(tài)位中的TAM存在（圖2A）。
3. 重要的是，這些染色與定義Ivy GAP轉(zhuǎn)錄生態(tài)位特征的分類相重疊（圖2B）。
4. 此外，針對(duì)每種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型的特定基因列表被用來根據(jù)該位置最代表性的亞型對(duì)點(diǎn)進(jìn)行分類（圖2B）。
5. 我們使用一個(gè)3步分類策略來分配巨噬細(xì)胞亞群分布，以關(guān)聯(lián)生態(tài)位和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型（圖S2A）。
6. 這種方法揭示了TAM亞群和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤中的豐富程度和空間共定位，這些腫瘤來自兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GEMMs（圖2C和2D）。

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• 圖 2. 類似MES的癌細(xì)胞和GPNMBhigh TAMs在缺氧生態(tài)位中共定位（A）代表性免疫熒光染色，用于VISIUM 10X空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的冷凍新鮮腦腫瘤切片。（B）根據(jù)VISIUM 10X測序點(diǎn)（見STAR方法）對(duì)主導(dǎo)生態(tài)位和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)錄活性的分類可視化。（C）空間共存工作流程：將TAM亞群、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型和生態(tài)位的轉(zhuǎn)錄模塊分配給每個(gè)點(diǎn)，以推斷相關(guān)系數(shù)。（D）中央：TAM亞群轉(zhuǎn)錄模塊與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型（頂部）或微解剖生態(tài)位轉(zhuǎn)錄模塊（底部）在所有VISIUM 10X樣本中的相關(guān)性矩陣；點(diǎn)顏色和大小對(duì)應(yīng)于相關(guān)系數(shù)。TAM亞群、腫瘤生態(tài)位或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型在復(fù)發(fā)性與原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的出現(xiàn)LogFC顯示在矩陣的底部和右側(cè)；數(shù)據(jù)表示為平均值+S.D.（E-G）空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的代表可視化，突出顯示GPNMBhigh匱乏（1）和豐富（2）區(qū)域。將分配為GPNMBlow或GPNMBhigh的點(diǎn)覆蓋在相應(yīng)的IF圖像上（E），并與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型（F）或微解剖生態(tài)位（G）平行，如（B）中所定義。統(tǒng)計(jì)：Kendall趨勢檢驗(yàn)（D）（?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001）。另見圖S2和表S2。

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• 圖S2.巨噬細(xì)胞亞群的空間分析及驗(yàn)證脂質(zhì)負(fù)載巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上代表高級(jí)別GBM腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)中的GPNMBhigh，與圖2和圖3相關(guān)（A）使用來自PDG-Ink4a原發(fā)腫瘤的代表性Visium 10X數(shù)據(jù)集，確定巨噬細(xì)胞亞群空間分布的3步分類策略示意圖。
• 在將斑點(diǎn)點(diǎn)確定為泛巨噬細(xì)胞特征（Aif1、Lgals3、Itga1、Trem2、P2ry12和Siglech）陽性后，根據(jù)微glia特異性基因表達(dá)（P2ry12和Siglech）將斑點(diǎn)歸類為MG或MDMs。
• 為每個(gè)MG或MDM簇使用特定的基因特征（見表S1H），以分配亞群得分。
• 最高的亞群得分將每個(gè)相應(yīng)的點(diǎn)分類到TME中的特定TAM亞群（右圖）。
• （B）代表性IF圖像，顯示新鮮冷凍的PDG-Ink4a小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織切片中的初級(jí)組織切片。
• DAPI：核染料（藍(lán)色）；IBA1：泛巨噬細(xì)胞（洋紅色）；PLIN2：脂滴（LDs）（白色）；BODIPY：中性脂質(zhì)標(biāo)記（黃色）。
• IBA1陽性但PLIN2和BODIPY陰性的細(xì)胞被鑒定為非LLMs（左放大）。
• IBA1、PLIN2和BODIPY均陽性的細(xì)胞被鑒定為LLMs（右放大）。
• （C）IF定量LLMs（IBA1+細(xì)胞，表面面積為≥500像素[0.325μm/像素]且含有≥5個(gè)PLIN2+斑點(diǎn)[定義為LDs]）作為PDG-Ink4a荷瘤小鼠原發(fā)性及復(fù)發(fā)性腫瘤中總TAMs的百分比。
• （D）在PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤中，低氧和無低氧區(qū)域中LLMs的定量。
• 連接的點(diǎn)對(duì)代表相同的樣本。
• （E）代表性流式細(xì)胞術(shù)圖，展示復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中LLM FACS純化的門控策略。
• 活巨噬細(xì)胞（CD45+CD11b+Ly6ClowLy6Glow）的每個(gè)TAM亞群（MG；CD49dlow）和MDMs（CD49dhigh）根據(jù)SSC-A（粒度）和BODIPY（中性脂質(zhì)）強(qiáng)度被分類為LLMs或非LLMs（與其起源無關(guān)）。
• （F）熱圖描繪了RNA-seq分析中LLMs和非LLMs之間標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)的對(duì)數(shù)倍變化。
• 熱圖中顯示的基因在圖3B中所示的脂質(zhì)負(fù)載MG和MDMs中普遍上調(diào)。
• 統(tǒng)計(jì)方法：兩階段逐步非配對(duì)t檢驗(yàn)（C）或雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)（D）。
• 數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（C）。

Para_01

1. 空間轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)，屬于預(yù)激活MG1-P2RY12群集的MG確實(shí)在腫瘤LE中富集（圖2D）。
2. 重要的是，盡管所有MDM群集都與MES1亞型相關(guān)，但GPNMBhigh TAMs特異性地與MES2膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存在相關(guān)，尤其是在PAN生態(tài)位中，這兩種細(xì)胞類型都豐富且它們的相互作用增強(qiáng)（圖2D-2G）。
3. 我們識(shí)別出在TME中表達(dá)脂滴標(biāo)記物perilipin-2（PLIN2）和中性脂質(zhì)染色BODIPY的TAMs，確認(rèn)了特定TAM亞群中脂滴的積累（圖S2B）。
4. 與PDG-Ink4a模型中OPC向MES轉(zhuǎn)變后的RT期間GPNMBhigh亞群富集一致（圖1D和2D），在復(fù)發(fā)時(shí)觀察到顯示脂質(zhì)負(fù)荷表型（PLIN2+脂滴水平高和大小增加）的TAMs顯著增加（圖S2C）。
5. 此外，結(jié)合PLIN2染色和pimonidazole確認(rèn)了LLMs在缺氧區(qū)積累，尤其是在MES2膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞所在的復(fù)發(fā)環(huán)境中（圖1D和S2D）。
6. 這些發(fā)現(xiàn)突顯了GPNMBhigh TAMs與缺氧生態(tài)位中的MES樣腫瘤細(xì)胞之間的復(fù)雜互惠通訊，并表明GPNMBhigh巨噬細(xì)胞顯示出特有的脂質(zhì)負(fù)荷表型。

LLMs display metabolic and immunosuppressive programs associated with altered chromatin landscapes and promote glioblastoma relapse post-RT

LLMs顯示出與改變的染色質(zhì)景觀相關(guān)的代謝和免疫抑制程序，并促進(jìn)放療后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)

Para_01

1. 為了探索脂質(zhì)負(fù)荷的GPNMBhigh TAM的形成起源，我們首先驗(yàn)證了GPNMBhigh巨噬細(xì)胞與LLMs無法區(qū)分，并對(duì)來自PDG-Ink4a腫瘤的FACS純化的脂質(zhì)富集（BODIPYhigh，SSC-Ahigh）MG和MDMs進(jìn)行了RNA-seq分析（圖3A和S2E）。
2. 通過比較MG和MDM亞群中的LLMs和非LLMs之間的差異表達(dá)基因，我們鑒定出在LLMs和非LLMs之間特有和共享的基因簽名，這些基因來自不同的起源（圖3B；表S3A和S3B）。
3. 在來自組織駐留或單核細(xì)胞來源的FACS純化LLMs中普遍上調(diào)的基因與GPNMBhigh TAM轉(zhuǎn)錄簽名中的幾個(gè)基因重疊（圖1I和S2F）。
4. 實(shí)際上，GPNMBhigh巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與LLMs重疊，證實(shí)了GPNMBhigh巨噬細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中確實(shí)是脂質(zhì)負(fù)荷的（圖3C）。
5. 這些發(fā)現(xiàn)促使我們將GPNMBhigh TAMs稱為LLMs，并使用GPNMBhigh簽名來轉(zhuǎn)錄識(shí)別LLMs。

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• 圖 3. 脂肪負(fù)載巨噬細(xì)胞的促腫瘤生成表型與染色質(zhì)可及性的丟失相關(guān)（A）脂肪負(fù)載巨噬細(xì)胞（LLM）多組學(xué)分析的示意圖。（B）FACS 分離的 MG 和 MDM 亞群中非 LLM 和 LLM 的 RNA-seq 識(shí)別的差異表達(dá)基因的維恩圖。（C）堆疊小提琴圖描繪了根據(jù) FACS 純化的巨噬細(xì)胞亞群 RNA-seq 分析鑒定的基因特征（表 S1D）在圖 1E 中的 TAM 亞群轉(zhuǎn)錄富集情況。（D）不同染色質(zhì)可及性區(qū)域巨噬細(xì)胞亞群的平均峰型圖譜（頂部）和熱圖（底部），顯示歸一化的 ATAC-seq（通過測序檢測轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)的分析）信號(hào)。（E）與非 LLMs 相比，LLM 啟動(dòng)子區(qū)域基因表達(dá)與更高和更低的可及性相關(guān)的 LogFC，基于 MG 和 MDM 亞群中相同基因的表達(dá)。（F）基于 MDM-LLMs 相較于非 LLMs 的啟動(dòng)子可及性更高或更低相關(guān)的基因表達(dá)顯著富集基因集的 Log10(FDR, 假發(fā)現(xiàn)率)。（G）來自 MDM 亞群的歸一化相關(guān) ATAC-seq 峰信號(hào)。（H）巨噬細(xì)胞亞群中 H3K27me3 的流式細(xì)胞術(shù) MFI。（I）巨噬細(xì)胞亞群中指定細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)的 MFI 的 Log2FC。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見圖 S3J。（J）流式細(xì)胞術(shù)定量 LLMs（BODIPYhigh, SSC-Ahigh）。（K）Kaplan-Meier 曲線顯示對(duì)照組（DMSO）；RT（5x2 Gy）和 DMSO；SSO（每天 30 mg/kg 治療）；或 RT + SSO 治療組隨時(shí)間變化的動(dòng)物生存情況。（L）來自（K）治療組中 LLMs（BODIPYhigh, SSC-Ahigh）的流式細(xì)胞術(shù)定量。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)（E），兩因素方差分析伴 Sídák 多重比較校正（H 和 L），兩階段逐步上升未配對(duì) t 檢驗(yàn)伴 Benjamini、Krieger 和 Yekutiel 多重比較校正（J），或?qū)?shù)秩檢驗(yàn)（K）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± SEM（H–J 和 L）。另見圖 S2、S3 和 S4 以及表 S3 和 S4。

Para_01

1. 為了深化我們對(duì)驅(qū)動(dòng)大脂質(zhì)巨噬細(xì)胞（LLM）形成的潛在機(jī)制的理解，我們檢查了通過FACS純化的含脂質(zhì)和不含脂質(zhì)的MG和MDM的染色質(zhì)狀態(tài)和可及性（圖3A）。
2. 我們確認(rèn)MG和MDM顯示出與它們胚胎起源相關(guān)的基因表達(dá)所特有的發(fā)育特異性峰（分別是Sall135和Itga4,10）（圖S3A）。
3. 與MG相比，MDM顯示出更多的可及性調(diào)控元件，支持這樣的觀點(diǎn)，即組織印記限制了巨噬細(xì)胞向功能特化的可塑性（圖S3B）。
4. 在非含脂質(zhì)MDM中富集的峰被鑒定為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路的基因，而在非含脂質(zhì)MG特有的峰與調(diào)節(jié)組織常駐功能的基因表達(dá)相關(guān)（圖S3C和S3D；表S4A-S4H）。

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• 擴(kuò)展的特定于個(gè)體發(fā)生的富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞染色質(zhì)景觀分析，與圖3相關(guān)（A）與MG特定（Sall1）或MDM特定（Itga4）的可訪問性相關(guān)的基因區(qū)域在LLMs和非LLMs中的MG和MDM亞群中的標(biāo)準(zhǔn)化ATAC-seq信號(hào)。（B）維恩圖描繪了非富含脂質(zhì)的MG和MDM中的ATAC-seq的共識(shí)峰數(shù)。（C和D）直方圖顯示了基于（B）中描繪的差異表達(dá)基因的非富含脂質(zhì)的MDM（C）和MG（D）中顯著富集基因集的-log10(FDR)。垂直線在-log10(FDR)=2處表示顯著性閾值。顏色表示差異可訪問基因和基因集之間的重疊。（E）維恩圖描繪了基于ATAC-seq分析確定的MG（頂部）和MDM（底部）中的LLMs與非LLMs之間的共識(shí)峰。（F）點(diǎn)圖描繪了源自單核來源的LLMs（左）和非LLMs（右）中所有差異可訪問峰的motif富集分析的-log10(FDR)。顏色代表差異可訪問峰與所有檢測到的峰（背景）相比的logFC。相關(guān)的motif簇用藍(lán)色突出顯示，與這些motif相關(guān)的TFs在底部面板中給出。（G）熱圖描繪了基于變量x軸的比較的染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的logFC，這是從批量RNA-seq分析（如圖3B所示）確定的。（H）直方圖描繪了來自復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤攜帶小鼠的MG（紫色）和MDM（藍(lán)色）亞群中的LLMs和非LLMs的H3K27me3的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。（I）來自原發(fā)性（左）和復(fù)發(fā)性（右）PDG-Ink4a腫瘤攜帶小鼠的MG和MDM亞群中的LLMs和非LLMs的EZH2的平均熒光強(qiáng)度（MFI）的量化。（J）與同一原發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)瘤樣本中的非富含脂質(zhì)的MG和MDM相比，富含脂質(zhì)的MG（左）和MDM（右）中描述的細(xì)胞表面標(biāo)記物的MFI。統(tǒng)計(jì)方法：兩階段逐步增加的多重配對(duì)t檢驗(yàn)，使用Benjamini，Krieger和Yekutieli校正進(jìn)行多重測試（H-J）。數(shù)據(jù)以均值+SEM（H-J）表示。

Para_01

1. 我們接下來評(píng)估了與脂質(zhì)負(fù)荷表型相關(guān)的染色質(zhì)景觀變化。
2. 無論其發(fā)生學(xué)如何，LLMs 與非LLM對(duì)照組相比，失去了對(duì)許多染色質(zhì)區(qū)域的訪問權(quán)限，而獲得的峰明顯較少，顯示出更為微妙的變化（圖3D和S3E）。
3. 有趣的是，只有脂質(zhì)負(fù)荷的MDMs中，染色質(zhì)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的可及性與基因表達(dá)相關(guān)，而在脂質(zhì)負(fù)荷的MG中則不然（圖3E）。
4. 脂質(zhì)負(fù)荷MDMs中低染色質(zhì)可及性與炎癥通路相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，例如H2-Eb1和Cd74（圖3F和3G）。
5. 重要的是，與無非脂質(zhì)負(fù)荷MDMs相比，脂質(zhì)負(fù)荷MDMs在脂質(zhì)運(yùn)輸（Abca1）、吞噬作用和突觸修剪相關(guān)基因中獲得了特定峰，同時(shí)失去了與膽固醇生物合成（Dhcr24）相關(guān)基因區(qū)域的可及性（圖3F和3G）。
6. 我們接下來對(duì)這些峰進(jìn)行了基序分析，結(jié)果顯示在無非脂質(zhì)負(fù)荷MDMs中富集了NF-κB（核因子 kappa-輕鏈增強(qiáng)子活化的B細(xì)胞）和RUNX（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子），這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子已知可介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖S3F）。
7. 相比之下，脂質(zhì)負(fù)荷MDMs顯示出富集了已知參與巨噬細(xì)胞免疫抑制表型的TFs，如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）和激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）（圖S3F）。

Para_02

1. 有趣的是，H3K27me3組蛋白去甲基化酶Kdm6b在脂肪負(fù)荷的巨噬細(xì)胞（MG）和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（MDMs）中均顯著下調(diào)（圖S3G）。
2. 這些發(fā)現(xiàn)表明，Kdm6b介導(dǎo)的H3K27me3抑制性組蛋白標(biāo)記的丟失是LLM炎癥基因染色質(zhì)可及性降低的基礎(chǔ)。
3. 流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，與未負(fù)荷脂肪的MDMs相比，脂肪負(fù)荷MDMs中的H3K27me3水平升高。
4. MG中升高的H3K27me3水平與它們較低的染色質(zhì)可及性狀態(tài)相關(guān)，這可能阻礙了原發(fā)性腫瘤和復(fù)發(fā)性腫瘤中來自TME的外在信號(hào)的整合（圖3H和S3H）。
5. 除了下調(diào)Kdm6b外，LLMs還顯示出EZH2（Enhancer Of Zeste Homolog 2）水平增加，這是H3K27me3的主要催化酶。
6. 與MDMs相比，MG中較高的EZH2水平與其脂肪負(fù)荷表型無關(guān)，這可能是組織駐留MG中H3K27me3基礎(chǔ)水平升高的基礎(chǔ)（圖S3I）。

Para_03

1. 脂質(zhì)負(fù)荷的MG和MDMs與它們的非LLM對(duì)應(yīng)物相比顯示出增強(qiáng)的免疫抑制特征，包括CD39和PD-L1（程序性死亡配體1）水平的增加（圖3I和S3J）。
2. 特別是，脂質(zhì)負(fù)荷的MDMs下調(diào)了主要組織相容性復(fù)合體（MHC-II）的表達(dá)，這表明當(dāng)MDMs獲得LLM表型時(shí)，抗原呈遞功能受損（圖3I）。
3. 有趣的是，LLMs中的脂質(zhì)受體CD36表達(dá)上調(diào)（圖3I），這與我們之前觀察到的LLMs特有的脂滴積累特征相一致（圖S2B）。
4. 復(fù)發(fā)PDG-Ink4a型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中脂質(zhì)負(fù)荷MDM的含量增加，與scRNA-seq揭示的OPC向MES的轉(zhuǎn)化相一致（圖1D和3J）。
5. 重要的是，在未經(jīng)治療的NF1驅(qū)動(dòng)的MES主導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型42中，脂質(zhì)負(fù)荷MDM富集與MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤之間的關(guān)聯(lián)得到了證實(shí)（圖3J）。
6. 總的來說，我們的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步鞏固了MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與LLMs之間的關(guān)聯(lián)，其免疫抑制和脂質(zhì)相關(guān)表型部分是由Kdm6b的下調(diào)和EZH2的上調(diào)驅(qū)動(dòng)的。
7. 因此，脂質(zhì)負(fù)荷MDMs中H3K27me3抑制性標(biāo)記的升高與炎癥基因下調(diào)背后的染色質(zhì)可及性的喪失相關(guān)。

Para_04

1. 接下來，我們評(píng)估了LLMs在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展中的功能意義，通過針對(duì)CD36，一個(gè)主要由含脂質(zhì)的MDMs和MG優(yōu)先表達(dá)的脂質(zhì)受體（圖3I、S4A和S4B）。
2. 基于PDG-Ink4a模型中LLM頻率的動(dòng)力學(xué)（圖S4C），我們在放療完成后兩天開始每天縱向治療使用血腦屏障可通透的CD36抑制劑磺基琥珀酰亞胺油酸（SSO）43（圖S4D）。
3. 重要的是，與單獨(dú)放療相比，SSO治療結(jié)合放療可顯著提高攜帶膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠的生存率（圖3K）。
4. 與RT +vehicle相比，RT +SSO中的LLM頻率呈中度下降，僅MDM-TAM亞群中差異顯著（圖3L和S4E）。
5. 經(jīng)SSO處理的腫瘤顯示出MHC-II+ MDMs的群體顯著增加（圖S4F），而淋巴免疫組成和活化保持不變（圖S4G-S4I）。
6. 這些實(shí)驗(yàn)建立了針對(duì)LLMs的潛在概念驗(yàn)證，促使我們進(jìn)一步研究它們在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME中出現(xiàn)的機(jī)制基礎(chǔ)及其促腫瘤功能。

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• 圖S4：驗(yàn)證髓鞘來源脂質(zhì)作為TAM表型的調(diào)節(jié)劑，其可以通過CD36抑制與放療聯(lián)合使用來改變，與圖3和圖4相關(guān)（A）點(diǎn)圖顯示小鼠單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集中最豐富細(xì)胞類型的CD36 RNA表達(dá)水平。顏色代表平均表達(dá)水平；大小表示表達(dá)Cd36的細(xì)胞百分比。
• （B）在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，對(duì)經(jīng)過RT處理的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤中各種細(xì)胞群體的CD36平均熒光強(qiáng)度（MFI）進(jìn)行量化。腫瘤細(xì)胞：CD45?CD11b?CD31?細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞：CD45?CD11b?CD31+細(xì)胞。所有巨噬細(xì)胞和LLM巨噬細(xì)胞：見圖S2E。
• （C）流式細(xì)胞術(shù)量化原發(fā)、放療后2天（5×2 Gy）以及復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的脂質(zhì)負(fù)荷（BODIPYhighSSC-Ahigh）MG（左）和MDMs（右）。
• （D）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和治療方案的示意圖。按照STAR方法描述的方法啟動(dòng)腫瘤，以產(chǎn)生PDG-Ink4a腫瘤攜帶小鼠。在腫瘤啟動(dòng)后4-6周，通過MRI對(duì)腫瘤大小進(jìn)行量化，并使用區(qū)組隨機(jī)化方法根據(jù)腫瘤體積（20–90 mm3）均勻分配小鼠至治療各組。治療組為對(duì)照（DMSO）、分割放療（RT，5×2 Gy）以及DMSO、SSO（每天30 mg/kg）或RT+SSO。
• DMSO和SSO治療在聯(lián)合治療組中在最后一次RT劑量后48小時(shí)開始。在出現(xiàn)癥狀或指定的時(shí)點(diǎn)處死小鼠。
• （E）圖表展示在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，經(jīng)過RT+DMSO和RT+SSO治療后，從復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤中分離的MG（左）和MDMs（右）的脂質(zhì)代謝標(biāo)記物的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。
• （F）流式細(xì)胞術(shù)量化MHC-II+ MDMs作為總MDMs的百分比，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)經(jīng)過RT+DMSO和RT+SSO治療的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤。
• （G）量化CD3+淋巴樣細(xì)胞群體（作為CD45+細(xì)胞的百分比），在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)經(jīng)過RT+DMSO或RT+SSO治療的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。B細(xì)胞：NK1.1?CD19+；CD8T細(xì)胞：NK1.1?CD19?CD3+CD8+；CD4T細(xì)胞：NK1.1?CD19?CD3+CD4+。
• （H和I）圖表展示在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)經(jīng)過RT+DMSO或RT+SSO治療的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，CD8 T細(xì)胞（H）和CD4 T細(xì)胞（I）的所示活化標(biāo)記物的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。
• （J）膽固醇從頭生物合成途徑的示意圖，描繪了膽固醇前體和衍生物以及涉及的酶（斜體）。通過脂質(zhì)組學(xué)（圖4A-4C）和RNA-seq（圖4D）確定的LLMs中增加的酶和中間體用綠色標(biāo)記，減少的用紅色標(biāo)記。
• （K）代表性IF圖像，展示新鮮冷凍的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織切片中LLM相對(duì)于髓鞘堿性蛋白的位置。DAPI：核染（藍(lán)色）；IBA1：泛巨噬細(xì)胞（洋紅色）；PLIN2：脂滴（LDs）（白色）；髓鞘堿性蛋白（MBP）（黃色）。T，腫瘤；H，相鄰的正常大腦。
• （L）餅圖展示從健康小鼠大腦中分離的髓鞘中發(fā)現(xiàn)的每種主要脂質(zhì)物種的平均比例。此圖的數(shù)據(jù)通過NMR量化膽固醇（紅色）以及通過Lipidyzer分析量化其他脂質(zhì)類別（灰色）。統(tǒng)計(jì)方法：混合效應(yīng)分析（B和C）或兩因素方差分析，Sídák校正進(jìn)行多重比較（E-I）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（B和G-I），±SEM（C、E和F）或±SD（L）。

Myelin debris in the TME drives cholesterol accumulation and LXR activation in TAMs

腫瘤微環(huán)境中的髓鞘碎片驅(qū)動(dòng) TAMs 中膽固醇積累和 LXR 激活

Para_01

1. 我們研究了LLMs與非LLM對(duì)照在體內(nèi)特有的脂質(zhì)體景觀，這可能是它們促進(jìn)腫瘤形成的特性的基礎(chǔ)。脂質(zhì)組學(xué)分析顯示LLMs中固醇、鞘磷脂、膽固醇酯（CEs）和三酰甘油的水平升高（圖4A）。值得注意的是，LLMs中膽固醇及其前體物質(zhì)的水平升高，例如5α-7,24-膽固醇二烯、羊毛甾醇和脫莫瓦龍酸（圖4B和4C）。有趣的是，參與膽固醇從頭合成途徑的多個(gè)酶的下調(diào)（圖4D和S4J）表明，LLMs中觀察到的膽固醇積累來源于TME中的外部來源，而不是從頭合成。這些發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)退行性疾病中泡沫狀巨噬細(xì)胞的表型相呼應(yīng)，其中膽固醇豐富的髓鞘碎片吞噬作用觸發(fā)膽固醇積累和膽固醇生物合成關(guān)閉。這種負(fù)反饋導(dǎo)致膽固醇前體物質(zhì)如脫莫瓦龍酸的積累，進(jìn)而激活肝X受體（LXR），通過增加膽固醇外流來克服膽固醇過載。
2. ,

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• 圖4：LLM的形成依賴于髓鞘吞噬作用及隨后的固醇積累（A和B）所示脂質(zhì)類別的標(biāo)準(zhǔn)化水平（圖S6J中的縮寫）以及FACS純化的LLM和非LLM中固醇的校正面積比。（C）根據(jù)（B）中的脂質(zhì)組學(xué)分析評(píng)估的FACS純化的LLM和非LLM中的脫氫膽固醇濃度。（D）根據(jù)圖3B中的FACS純化的LLM和非LLM的膽固醇合成途徑基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)。（E）從腫瘤中分離出的髓鞘中存在的主要脂質(zhì)種類的平均比例。（F）初級(jí)PDG-Ink4a腫瘤切片的代表性電子顯微鏡圖像。框1.2和2.2分別是框1.1和2.1的高倍圖像。（G）初級(jí)PDG-Ink4a腫瘤切片的代表性IF圖像。DAPI：核染料（藍(lán)色）；IBA1：泛巨噬細(xì)胞（洋紅色）；PLIN2：脂滴（白色）；MBP：髓鞘堿性蛋白（黃色）。（H）初級(jí)PDG-Ink4a腫瘤中TAM亞群的平均MBP強(qiáng)度定量（如圖S4K所示）。每個(gè)點(diǎn)代表單個(gè)TAM（IBA1+），大小對(duì)應(yīng)細(xì)胞面積。（I）代表一個(gè)IBA1+PLIN2+LLM的視覺IF圖像，以及用于注釋單個(gè)TAM（IBA1+）作為MBP+（與MBP的最小距離小于0像素），靠近MBP（0-5像素）或遠(yuǎn)離MBP（>5像素）的距離到髓鞘。（J）根據(jù)（I）中描述的每個(gè)TAM的最小距離與MBP+染色的相關(guān)性，定量每個(gè)TAM中存在的脂滴總數(shù)。（K）圖S5C所示的體外LLM的流式細(xì)胞術(shù)定量。（L）根據(jù)（K）中使用的FACS純化的dTomato+BMDMs的RNA-seq確定的差異表達(dá)基因（表S5A）。（M）根據(jù)（L）得出的特征進(jìn)行GSEA富集的相關(guān)途徑的p值（表S5B-S5J）。統(tǒng)計(jì)方法：兩因素方差分析，采用Sídák校正進(jìn)行多重比較（A和B），雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)（C和D），成對(duì)比較分析成對(duì)的多種群均值（H），成對(duì)比較分析成對(duì)的多種群均值（J），單因素方差分析，采用Sídák校正進(jìn)行多重比較（K），結(jié)合Benjamini-Hochberg校正的Fisher精確檢驗(yàn)（M）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（A-D和K）或±SD（E）。另見圖S4和S5及表S5。

Para_01

1. 為了探討髓鞘作為賦予TAMs LLM表型的脂質(zhì)關(guān)鍵來源的潛力，我們首先使用髓鞘堿性蛋白（MBP）作為標(biāo)志物，探查了腫瘤組織中髓鞘的存在。
2. 在TME中，與PLIN2+LLMs相鄰的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了類似髓鞘碎片的結(jié)構(gòu)，其構(gòu)型與健康腦組織中的髓鞘相比發(fā)生了扭曲（圖S4K）。
3. 重要的是，從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤中分離出的髓鞘的脂質(zhì)組學(xué)分析，證實(shí)了膽固醇的過度表達(dá)，與非腫瘤負(fù)荷大腦中的髓鞘相似（圖4E和S4L）。
4. 探測脫髓鞘和再髓鞘化的轉(zhuǎn)錄特征45顯示與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤呈正相關(guān)，而與相鄰正常腦組織無關(guān)，證實(shí)了髓鞘碎片在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的積累（圖S5A和S5B）。
5. 這些發(fā)現(xiàn)暗示脫髓鞘和再髓鞘化途徑在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中被觸發(fā)，可能是TME中髓鞘碎片存在的基礎(chǔ)。
6. 重要的是，電子顯微鏡（EM）成像在體內(nèi)確認(rèn)了髓鞘碎片存在于巨噬細(xì)胞吞噬體中（圖4F）。
7. 此外，髓鞘吞噬和MBP在TAMs中的積累與尺寸增加和脂質(zhì)積累相連貫，表明巨噬細(xì)胞吞噬并回收髓鞘成脂質(zhì)（圖4G-4J）。
8. 這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞需要清除髓鞘碎片，以在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME中獲得LLM表型。

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Para_01

1. 為了確認(rèn)局部髓鞘碎片攝取在LLM形成中的作用，我們建立了一個(gè)離體共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中dTomato+骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDMs）暴露于分離的小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤中，這些腫瘤之前有或沒有經(jīng)過髓鞘耗竭處理（圖S5C）。
2. 有趣的是，整個(gè)分離的腫瘤或僅髓鞘碎片均導(dǎo)致了顯著的LLM形成，而在沒有髓鞘的情況下，這種效應(yīng)消失了（圖4K和S5D），這突顯了髓鞘作為脂質(zhì)來源對(duì)TAMs獲取富含脂質(zhì)的表型的重要作用。
3. 有趣的是，與僅含髓鞘的情況相比，添加整個(gè)腫瘤（含髓鞘）使總的脂質(zhì)含量增加了3倍，而僅含髓鞘的情況下增加了2倍（圖S5D），這表明TME在啟動(dòng)巨噬細(xì)胞LLM表型中有所貢獻(xiàn)。

Para_02

1. 為了解析來自腫瘤微環(huán)境（TME）或髓鞘本身的信號(hào)線索對(duì)LLM形成的貢獻(xiàn)，我們對(duì)來自體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的dTomato+ BMDMs進(jìn)行了FACS分離并進(jìn)行了RNA-seq（圖4L和S5C；表S5A-S5L）。
2. 有趣的是，參與吞噬作用和補(bǔ)體激活的通路的上調(diào)提示TME賦予了"吃我"信號(hào)，指導(dǎo)巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其吞噬能力（圖S5E）。
3. 重要的是，這些信號(hào)可能調(diào)節(jié)髓鞘的特異性攝取，因?yàn)闂l件培養(yǎng)基（CM）教育的巨噬細(xì)胞中CD36的抑制阻礙了髓鞘的吞噬，但并未損害微球體的吞噬（圖S5F）。
4. 正交地，髓鞘暴露誘導(dǎo)了參與膽固醇代謝和脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐繁磉_(dá)，同時(shí)下調(diào)了膽固醇生物合成（圖S5E），與體內(nèi)LLM特征相似（圖4D）。
5. 有趣的是，TME和髓鞘來源信號(hào)指導(dǎo)巨噬細(xì)胞教育的交叉點(diǎn)包括吞噬脂質(zhì)、吞噬作用和LXR通路激活的通路的上調(diào)，以及與脂質(zhì)輸出相關(guān)的基因（Abca1）表達(dá)的增加（圖4M）。
6. 令人驚訝的是，在髓鞘存在的情況下，TME特異性的教育促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)被抑制（圖4M），推斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)的炎癥被這種脂質(zhì)源所阻礙，從而促進(jìn)了LLM的免疫抑制表型（圖3I）。
7. 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)揭示TME來源的信號(hào)使巨噬細(xì)胞清除髓鞘碎片作為脂質(zhì)源。反過來，吞噬的髓鞘碎片驅(qū)動(dòng)膽固醇前體的積累，激活LXR，從而減弱炎癥活動(dòng)并上調(diào)LLM中的脂質(zhì)輸出。

MES-like glioblastoma cells enhance TAM-mediated myelin recycling and lipid export into the TIF

類似于MES的小膠質(zhì)母細(xì)胞增強(qiáng)TAM介導(dǎo)的髓鞘回收和脂質(zhì)向TIF的輸出

Para_01

1. 我們接下來旨在探究髓鞘回收在LLM（低級(jí)別孤立性腦膜瘤）與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞交互作用中的功能意義。為了在體外模擬這種相互影響，我們從原發(fā)或復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤中分別產(chǎn)生了類似OPC（少突膠質(zhì)細(xì)胞前體）和MES（間充質(zhì)樣）的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。
2. 原發(fā)/OPC樣和復(fù)發(fā)性/MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表達(dá)了它們所代表亞型的特征性基因，MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示糖酵解活動(dòng)顯著增加，代表它們在體內(nèi)的特性（見圖5A和S5G-S5J）。
3. 當(dāng)BMDMs（骨髓來源的巨噬細(xì)胞）被膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤條件化培養(yǎng)基（TCM）教育后，髓鞘碎片吞噬作用增強(qiáng)，而非一般吞噬作用（見圖S5K和S5L），導(dǎo)致脂質(zhì)積累增加（見圖5C和S6A），這與體內(nèi)LLM表型相似（見圖S2B和S2E）。
4. 類似地，TCM介導(dǎo)的原代MG（小膠質(zhì)細(xì)胞）的啟動(dòng)增加了對(duì)髓鞘碎片反應(yīng)的LLM形成（見圖S6B），強(qiáng)調(diào)髓鞘介導(dǎo)的LLM表型不僅限于MDMs（單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞）。
5. 盡管OPC樣和MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞都能指導(dǎo)BMDMs中的LLM形成，但MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的高度糖酵解特征（見圖5A和S5J）影響了此過程，如通過抑制糖酵解導(dǎo)致LLM生成減少所示（見圖S6C）。
6. 此外，暴露于髓鞘（而非TCM）觸發(fā)了H3K27me3的上調(diào)（見圖5D），強(qiáng)化了髓鞘在調(diào)控基因表達(dá)變化以獲得巨噬細(xì)胞LLM表型中的作用。

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• 圖 5. LLM 中的 LXR 信號(hào)通路激活促進(jìn) TME 內(nèi)的脂質(zhì)交換（A）在由原發(fā)/OPC 樣（n = 4）或復(fù)發(fā)性/MES 樣（n = 4）PDG-Ink4a 腫瘤生成的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系上進(jìn)行 Seahorse 糖酵解活性實(shí)驗(yàn)，隨時(shí)間變化的細(xì)胞外酸化速率（ECAR）。（B）BMDMs 中髓鞘羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）攝?。∕FI）的相對(duì)倍數(shù)變化。（C）BMDMs 在髓鞘暴露下相對(duì)于對(duì)照組（無髓鞘）的 BODIPY MFI 相對(duì)倍數(shù)變化。（D）BMDMs 在單培養(yǎng)（±髓鞘）或與 MES 樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí) H3K27me3 MFI 的相對(duì)倍數(shù)變化。（E 和 F）通過定量實(shí)時(shí) PCR（RT-qPCR）評(píng)估 BMDMs 暴露于（E）對(duì)照培養(yǎng)基或 MES 樣 TCM 以及（F）MES 樣 TCM ± 髓鞘時(shí)的 LXR 信號(hào)通路基因的相對(duì)表達(dá)。（G）在小鼠單細(xì)胞 RNA 測序數(shù)據(jù)集（圖 1B）中確定的最多細(xì)胞類型的脂質(zhì)輸出和脂蛋白受體基因的表達(dá)水平。（H）BMDMs 在體外與髓鞘接觸 24 小時(shí)后，上清液中游離膽固醇的量化。（I）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)說明從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中收集 TIF（參見 STAR 方法）。（J）TIF 中檢測到的總脂質(zhì)（峰值的總和）的相對(duì)水平。（K）TIF 中膽固醇酯（CE）水平與 Ntb 組織（對(duì)照）相比的倍數(shù)變化。統(tǒng)計(jì)方法：Friedman 測試配合 Dunn 多重比較校正（B、C、J 和 K），單因素方差分析配合 Sídák 校正（D），雙因素方差分析配合 Sídák 多重比較校正（E 和 F），或雙尾配對(duì) t 檢驗(yàn)（H）。數(shù)據(jù)表示為平均值 + SEM（A-C）或 ± SEM（D-F、H、J 和 K）。另見圖 S5 和 S6。

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• 圖S6. 分析巨噬細(xì)胞中髓鞘誘導(dǎo)的LXR激活，該細(xì)胞在TME中協(xié)調(diào)脂質(zhì)交換，與圖5相關(guān)（A）代表來自BMDMs的流式細(xì)胞術(shù)圖，BMDMs暴露于MES樣TCM±髓鞘，如圖S5K所示。門控設(shè)置在BODIPYhigh和SSC-Ahigh的BMDMs上，以識(shí)別LLMs in vitro。（B）流式細(xì)胞術(shù)定量LLMs（BODIPYhigh，SSC-Ahigh）作為先前暴露于對(duì)照培養(yǎng)基或MES樣TCM的主要小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）的百分比，髓鞘碎片暴露后24小時(shí)（3小時(shí)）。（C）MES樣TCM培養(yǎng)的BMDMs暴露于髓鞘（3小時(shí)）后的BODIPY MFI倍數(shù)變化，與未暴露于髓鞘的情況相比。MES樣TCM取自用糖酵解抑制劑2-DG處理或不處理的細(xì)胞（圖S5K）。通過流式細(xì)胞術(shù)使用BODIPY染色評(píng)估BMDMs對(duì)髓鞘攝取的脂質(zhì)積累。（D和E）通過qPCR評(píng)估代表LLM特征的基因的表達(dá)（如圖1I所示），BMDMs暴露于（D）MES樣TCM±髓鞘1小時(shí)或24小時(shí)，（E）對(duì)照培養(yǎng)基或MES樣TCM單獨(dú)。（F）通過qPCR評(píng)估BMDMs在MES樣TCM條件下暴露于髓鞘±LXR抑制劑時(shí)Abca1、Abcg1、Dhcr24和Nr1h3的相對(duì)表達(dá)。（G和H）對(duì)Filipin（膽固醇染色）進(jìn)行了體外BMDMs的免疫熒光染色，BMDMs在MES樣TCM±LXR抑制劑（LXRi）條件下培養(yǎng)24小時(shí)，并暴露或未暴露于髓鞘（3小時(shí)）。直方圖描繪每個(gè)BMDM（G）或BMDMs中的每個(gè)脂質(zhì)滴（H）的Filipin平均強(qiáng)度。線條代表中位數(shù)和四分位數(shù)。（I）小提琴圖描繪了從小鼠單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集中提取的膽固醇外流相關(guān)基因Abca1、Abcg1、Apoc1和Apoe在LLMs和非LLMs中的標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)水平。（J）通過脂質(zhì)組學(xué)分析，在原發(fā)性/OPC樣和復(fù)發(fā)性/MES樣PDG-Ink4a腫瘤的TIF中定量所示的脂質(zhì)類與非腫瘤大腦（Ntb）組織相比的倍數(shù)變化。BRSE，菜油酸酯；CASE，菜油酸酯；CL，心磷脂；CE，膽固醇酯；Cer_BS，神經(jīng)酰胺β-羥基脂肪酸-鞘磷脂；Cer_NS，神經(jīng)酰胺非羥基脂肪酸-鞘磷脂；CoQ，輔酶Q；DG，二酰甘油；FA，游離脂肪酸；LPC，溶血磷脂酰膽堿；LPI，溶血磷脂酰肌醇；MGDG，單半乳糖基二酰甘油；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰膽堿；PE，磷脂酰乙醇胺；PE_Cer，神經(jīng)酰胺磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；PI_Cer，神經(jīng)酰胺磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰絲氨酸；SHexCer，硫苷脂；SM，鞘磷脂；SSulfate，固醇硫酸酯；TG，三酰甘油；CAR，酰基肉堿；ST，固醇。（K）Ntb小鼠、原發(fā)性/OPC樣和復(fù)發(fā)性/MES樣PDG-Ink4a腫瘤的間質(zhì)液中神經(jīng)酰胺（Cer）物種水平的相對(duì)倍數(shù)變化。（L）在Ntb、原發(fā)性、RT復(fù)發(fā)性和SSO處理的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤的間質(zhì)液中檢測到的總脂質(zhì)水平（總峰面積）。圖5J中的Ntb、原發(fā)性和復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a組的數(shù)據(jù)點(diǎn)。（M）在Ntb、原發(fā)性、RT復(fù)發(fā)性和SSO處理的復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a腫瘤的腫瘤間質(zhì)液（TIF）中定量膽固醇酯（CE）的相對(duì)水平。圖5K中的Ntb、原發(fā)性和復(fù)發(fā)性PDG-Ink4a組的數(shù)據(jù)點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)：雙向方差分析，Sídák校正進(jìn)行多重比較（B、D-F、J和K），兩階段逐步配對(duì)t檢驗(yàn)（C），或混合效應(yīng)分析，Sídák校正進(jìn)行多重比較（G、H、L和M）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（B、C和F）和±SEM（D、E和J-M）。

Para_01

1. 接下來，我們進(jìn)一步研究了LLM和MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞之間的相互作用，這是基于我們觀察到的這兩種細(xì)胞類型在轉(zhuǎn)錄水平和空間水平上的強(qiáng)烈相關(guān)性（圖1J和2D）。
2. 當(dāng)BMDM暴露于MES樣TCM+髓鞘碎片時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)BMDM獲取LLM特異基因，而這種誘導(dǎo)作用僅靠MES樣TCM是無法實(shí)現(xiàn)的（圖S6D和S6E）。
3. 盡管MES樣TCM能增加編碼LXR-α蛋白的Nr1h3基因表達(dá)（圖5E），但在此背景下需要髓鞘的存在來上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Abca1和Abcg1（均為LXR激活的下游分子）的表達(dá)，并下調(diào)Dhcr24的表達(dá)（圖5F），
4. 正如體內(nèi)觀察到的，這是細(xì)胞內(nèi)膽固醇和desmosterol積累的標(biāo)志，繼髓鞘攝取后發(fā)生（圖4B–4D和S4J）。
5. 如預(yù)期那樣，由于desmosterol在泡沫狀巨噬細(xì)胞形成過程中激活LXR的激動(dòng)作用，LXR的藥理抑制阻礙了髓鞘誘導(dǎo)的脂質(zhì)輸出基因Abca1和Abcg1的表達(dá)（圖S6F），導(dǎo)致膽固醇在巨噬細(xì)胞中積累（圖S6G和S6H）。
6. 這些膽固醇流出轉(zhuǎn)運(yùn)體主要在TAMs中表達(dá)（圖5G），并在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LLMs中上調(diào)（圖S6I）。
7. 與這種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)增加一致，巨噬細(xì)胞在體外攝取髓鞘后能有效流出膽固醇（圖5H）。
8. 這一發(fā)現(xiàn)促使我們評(píng)估原發(fā)/OPC樣和復(fù)發(fā)/MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤間質(zhì)液（TIF）中的脂質(zhì)含量（圖5I）。
9. 脂質(zhì)組學(xué)分析顯示，MES樣、LLM富集腫瘤的TIF中檢測到的總脂質(zhì)量增加（圖5J和S6J），包括CEs（圖5K），之前發(fā)現(xiàn)LLMs中CEs水平升高（圖4A）。
10. 由于CEs是高密度脂蛋白（HDLs）的主要成分，而HDL介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性在髓鞘暴露后巨噬細(xì)胞中上調(diào)（圖S5E），這些結(jié)果表明LLMs中HDL介導(dǎo)的膽固醇流出增加。
11. 此外，MES樣富集的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤顯示出神經(jīng)酰胺水平升高（圖S6K），這是一種與脫髓鞘有關(guān)的脂質(zhì)類別。
12. 總的來說，這些數(shù)據(jù)揭示了一種調(diào)節(jié)機(jī)制，其中髓鞘碎片增加的水平是MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中LLM積累的基礎(chǔ)。
13. 值得注意的是，經(jīng)SSO處理的阻礙LLM形成的復(fù)發(fā)性腫瘤（圖3K，3L和S4E）顯示出TIF總脂質(zhì)水平降低（圖S6L），包括CEs（圖S6M）。

Para_02

1. 總之，這些發(fā)現(xiàn)揭示了大脂質(zhì)分子不僅含有多種脂質(zhì)類別的增加水平，而且通過腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的LXR途徑的激活，將髓鞘來源的脂質(zhì)輸出到腫瘤間質(zhì)中。
2. 這些結(jié)果促使我們進(jìn)一步研究大脂質(zhì)分子介導(dǎo)的膽固醇外流對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞的惡性特征的意義。

Myelin-induced LLMs fuel MES-like glioblastoma cell malignancy

髓磷脂誘導(dǎo)的LLMs促進(jìn)類似MES的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性

Para_01

1. 為了確定膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在吞噬和加工髓鞘后如何從LLM衍生的脂質(zhì)中獲益，我們檢查了需要此類外部脂質(zhì)源的不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型的代謝特征。
2. 盡管腫瘤細(xì)胞普遍顯示出膽固醇從頭合成途徑的高轉(zhuǎn)錄活性（圖S7A），但MES樣細(xì)胞，尤其是MES2亞型，顯示出最低的膽固醇生物合成活性。
3. 實(shí)際上，與其它癌細(xì)胞亞型相比，MES樣細(xì)胞在多種脂質(zhì)生物合成途徑中表現(xiàn)出低活性（圖6A和6B），這一特征在患者樣本中也觀察到（圖S7B和S7C）。
4. 相反，MES2細(xì)胞表達(dá)了高水平的Vldlr（圖6B），這是一種HDL的膜受體，可能有利于它們清除含有LLM衍生的膽固醇的脂蛋白（圖S5E）。
5. 這使我們推測，以脂質(zhì)攝取和交換為中心的代謝串?dāng)_是MES樣細(xì)胞與LLM相互作用的核心。
6. 實(shí)際上，髓鞘中的脂質(zhì)并不容易獲得腫瘤細(xì)胞（圖S7D），當(dāng)暴露于髓鞘后，腫瘤細(xì)胞的增殖在巨噬細(xì)胞耗竭的ex vivo中減少了（圖S7E和S7F）。
7. 重要的是，通過重新引入巨噬細(xì)胞，可以挽救髓鞘對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞的脂毒性效應(yīng)，揭示了巨噬細(xì)胞在回收髓鞘碎片以保護(hù)并使腫瘤細(xì)胞受益中的重要性（圖S7F）。
8. 通過追蹤共培養(yǎng)中加載了可點(diǎn)擊膽固醇的BMDM中的脂質(zhì)命運(yùn)（圖S7G），我們發(fā)現(xiàn)直接轉(zhuǎn)移發(fā)生在MES樣而不是OPC樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中（圖6C）。
9. 為了探究腫瘤細(xì)胞是否清除LLM介導(dǎo)的髓鞘回收產(chǎn)生的脂質(zhì)，我們設(shè)計(jì)了一個(gè)多組學(xué)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，在不同條件的髓鞘暴露下，隨后對(duì)FACS純化的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞進(jìn)行定量脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（圖S7H）。
10. 在單培養(yǎng)中，暴露于髓鞘的MES樣細(xì)胞并未顯示脂質(zhì)含量改變（圖6D），這與它們無法吞噬髓鞘碎片的能力相符（圖S7D）。
11. 然而，在這種條件下，與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的過程被上調(diào)，而與增殖相關(guān)的途徑被降低（圖S7I和S7J），強(qiáng)調(diào)了髓鞘對(duì)腫瘤細(xì)胞的脂毒性特征（圖S7F；表S6A和S6B）。
12. 特別地，當(dāng)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)并在髓鞘存在下，多種脂質(zhì)類別逐漸在MES樣腫瘤細(xì)胞中積累，包括膽固醇和甘油三酯（TGs）（圖6D和6E）。
13. 在轉(zhuǎn)錄上，MES樣腫瘤細(xì)胞上調(diào)了多種參與增殖和細(xì)胞周期的途徑（圖S8A和S8B；表S6C-S6F）。
14. 總的來說，這些分析揭示了TAM/癌細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，通過這些機(jī)制，LLM處理的髓鞘衍生的脂質(zhì)促進(jìn)腫瘤生長。

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• 圖S7：在鼠腫瘤中保存的人間充質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤代謝特性，這是MES樣腫瘤細(xì)胞外包脂質(zhì)需求的底層，與圖6相關(guān)（A）點(diǎn)圖顯示在鼠單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集中識(shí)別的最豐富細(xì)胞類型中從頭合成膽固醇生物合成基因的表達(dá)水平（圖1B）。顏色代表平均表達(dá)；大小表示表達(dá)每個(gè)特定基因的細(xì)胞百分比。（B）點(diǎn)圖顯示在患者單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集中識(shí)別的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型中從頭合成膽固醇生物合成和導(dǎo)入基因的表達(dá)水平。點(diǎn)顏色代表平均表達(dá)；大小表示表達(dá)每個(gè)特定基因的細(xì)胞百分比。（C）雷達(dá)圖描繪了從患者單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集中提取的OPC、MES、NPC和AC膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞之間表示的代謝途徑（KEGG）的標(biāo)準(zhǔn)化GSEA評(píng)分（基于每個(gè)途徑在0到1之間）?；疑珔^(qū)域代表所有腫瘤細(xì)胞中每個(gè)代謝途徑的平均活性。（D）圖表顯示BMDMs或OPC樣和MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中CFSE標(biāo)記的髓鞘攝取的MFI。（E）ex vivo實(shí)驗(yàn)的示意圖，用于EdU和Annexin V染色，如圖F及圖6K和S8G-S8I所示。從PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤荷瘤小鼠中提取原發(fā)腫瘤，并在磁珠介導(dǎo)的髓鞘去除和/或CD11b+細(xì)胞耗竭之前分離成單細(xì)胞。然后將分離的腫瘤放置在培養(yǎng)中24小時(shí)，更換培養(yǎng)基以去除細(xì)胞碎片，并在指定時(shí)加入LXRi、ABCA1i或BMDMs。腫瘤細(xì)胞增殖（EdU染色）或活力（Annexin V-，Zombie-）在48小時(shí)后通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估。（F）直方圖顯示與無CD11b+ Abca1/Abcg1KO BMDMs±髓鞘的腫瘤細(xì)胞相比，S期（EdU+）腫瘤細(xì)胞的倍數(shù)變化。培養(yǎng)條件在（E）中描述。（G）體外LLM/膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖：如前所述（圖S5K），在OPC樣或MES樣TCM中培養(yǎng)的BMDMs過夜暴露于（1）可點(diǎn)擊的膽固醇或（2）髓鞘3小時(shí)，并與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。（1）通過流式細(xì)胞術(shù)測量BMDMs向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移膽固醇的攝取/轉(zhuǎn)移，在共培養(yǎng)0、1和3小時(shí)后進(jìn)行Click-iT反應(yīng)（見STAR Methods）。（2）共培養(yǎng)48小時(shí)后（EdU染色）通過流式細(xì)胞術(shù)測量膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。（H）體外LLM/MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌細(xì)胞共培養(yǎng)設(shè)計(jì)示意圖，研究巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的髓鞘回收對(duì)腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)錄組的影響：在添加BMDMs（或不添加）進(jìn)行共培養(yǎng)之前，MES樣腫瘤細(xì)胞在2%無脂質(zhì)FBS DMEM中生長。24小時(shí)后，根據(jù)需要在MES樣腫瘤細(xì)胞和BMDMs FACS分離之前添加髓鞘不同的持續(xù)時(shí)間（0、6或24小時(shí)），然后進(jìn)行下游批量RNA測序或脂質(zhì)組學(xué)分析（見STAR Methods）。（I）火山圖顯示MES樣腫瘤細(xì)胞在髓鞘碎片中培養(yǎng)24小時(shí)或未培養(yǎng)的差異性表達(dá)基因。顏色對(duì)應(yīng)于顯著增加（紅色）或減少（藍(lán)色）的基因。通過如圖H所示的FACS純化的MES樣腫瘤細(xì)胞的批量RNA測序識(shí)別基因。（J）條形圖顯示MES樣腫瘤細(xì)胞在單培養(yǎng)中對(duì)髓鞘暴露做出反應(yīng)時(shí)，與基因下調(diào)（藍(lán)色）或上調(diào)（紅色）相關(guān)的相關(guān)途徑的調(diào)整p值。統(tǒng)計(jì)方法：單向ANOVA（D）或雙向ANOVA與Sídák校正進(jìn)行多次比較（F）或Fisher精確檢驗(yàn)結(jié)合Benjamini-Hochberg方法進(jìn)行多假設(shè)檢驗(yàn)校正（J）。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM（D和F）

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• 圖6. LLM介導(dǎo)的脂質(zhì)輸出為脂質(zhì)匱乏的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME中的MES樣細(xì)胞惡行提供燃料（A）來自小鼠單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型中的歸一化GSEA評(píng)分?；疑珔^(qū)域=每個(gè)通路的平均代謝活動(dòng)。（B）來自小鼠單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞亞型中的膽固醇生物合成和導(dǎo)入基因的表達(dá)水平。（C）膽固醇含量在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與預(yù)先加載了可點(diǎn)擊膽固醇的BMDMs共培養(yǎng)后的流式細(xì)胞術(shù)MFI量化。（D）在MES樣腫瘤細(xì)胞與TAMs+髓鞘共培養(yǎng)或單培養(yǎng)中，與無髓鞘比較，描繪的脂質(zhì)類別的倍數(shù)表達(dá)變化（x軸）和-log10 p值（y軸）。（E）MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在單培養(yǎng)或與BMDMs共培養(yǎng)暴露于髓鞘時(shí)的膽固醇和甘油三酯（TG）水平。（F）在MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，基于脂質(zhì)ng/μg蛋白的標(biāo)記13C在各可量化脂質(zhì)類別中的相對(duì)分布，在給予CE13C-FA后24小時(shí)。（G）在檢測到U13C-FA18:1的脂質(zhì)種類中，每種脂質(zhì)種類代謝的CE13C-FA的量化。（H）在與TCM處理的BMDMs±髓鞘共培養(yǎng)48小時(shí)后，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在S期（EdU+）的百分比。（I）電子顯微鏡代表圖像，描繪MES樣腫瘤細(xì)胞（T）與載有髓鞘的BMDMs（M）之間的接觸點(diǎn)。LD，脂滴；CV，涂層囊泡；MD，髓鞘碎片。（J）在與TCM處理的BMDMs±髓鞘，±CD36抑制劑（SSO）±ABCA1抑制劑valspodar（ABCA1i）共培養(yǎng)48小時(shí)后，MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在S期（EdU+）的百分比。（K）在分離的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，維持（+CD11b+）或體外耗竭（-CD11b+）（圖S7E）±ABCA1i或LXR抑制劑GSK2033（LXRi）的情況下，活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（ZombieNIR-，Annexin V-）占總腫瘤細(xì)胞的百分比。統(tǒng)計(jì)：雙向方差分析（C，E，H和K）和帶Sídák校正的混合效應(yīng)分析進(jìn)行多重比較（J）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（C，E，G，H，J和K）。另見圖S7和S8及表S6。

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• 圖S8。關(guān)于巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的髓鞘回收在保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受脂毒性侵害以及以LXR-Abca1/Abcg1依賴方式為MES樣細(xì)胞供能的擴(kuò)展分析，與圖6相關(guān)（A）維恩圖描繪了在與BMDMs共培養(yǎng)的MES樣腫瘤細(xì)胞中，在無（對(duì)照）或存在髓鞘碎片（+髓鞘碎片）的情況下，與單培養(yǎng)的MES樣腫瘤細(xì)胞相比差異表達(dá)的基因（表S6）?；蛲ㄟ^圖S7H所述的FACS純化的MES樣腫瘤細(xì)胞的批量RNA-seq確定。（B）條形圖描繪了MES樣腫瘤細(xì)胞與BMDMs（±髓鞘碎片）共培養(yǎng)時(shí)，與單培養(yǎng)的MES樣腫瘤細(xì)胞相比下調(diào)（左）和上調(diào)（右）的通路p值（圖S7H）。（C）代表性IF圖像，顯示了MES樣腫瘤細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)（添加Click-CE后的0、8和24小時(shí)）暴露于含有膽固醇（左，黃色）或脂肪酸（右，粉紅色）的膽固醇酯（CEs）。（D）代表性流式細(xì)胞術(shù)繪圖，描述了EdU增殖分析的門控策略，其中EdU+細(xì)胞表示S期的細(xì)胞，如圖（E）、（F）和圖6H、6J所示。（E）圖表描繪了與預(yù)先暴露于髓鞘（3小時(shí)）或未暴露的TCM預(yù)處理的BMDMs共培養(yǎng)48小時(shí)后，處于S期（EdU+）的活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的百分比。（F）圖表描繪了與野生型或Abca1/Abcg1 KO BMDMs共培養(yǎng)48小時(shí)后，在MES樣TCM±髓鞘（3小時(shí)）預(yù)先培養(yǎng)的MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中S期（EdU+）細(xì)胞的百分比。（G）在體外實(shí)驗(yàn)中，將活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（ZombieNIR?，Annexin V?）占總腫瘤細(xì)胞（CD45?CD11b?細(xì)胞）的百分比進(jìn)行量化（圖S7E）。從攜帶腫瘤的小鼠中分離出PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，并將其解離成單細(xì)胞，在補(bǔ)充了富含脂質(zhì)的FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從解離的腫瘤中保持（+CD11b+）或耗盡（?CD11b+）髓樣細(xì)胞，并加入ABCA1抑制劑valspodar（ABCA1i）或LXR抑制劑GSK2033（LXRi）。（H和I）在體外實(shí)驗(yàn)中，將活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（ZombieNIR?，Annexin V?）占總腫瘤細(xì)胞（CD45?CD11b?細(xì)胞）的百分比進(jìn)行量化（圖S7E）。從攜帶腫瘤的小鼠中分離出PDG-Ink4a膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，并將其解離成單細(xì)胞，在補(bǔ)充了無脂質(zhì)FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在將野生型或Abca1/Abcg1 KO BMDMs（預(yù)先暴露于髓鞘碎片或未暴露）添加到解離的腫瘤中之前，耗盡髓樣細(xì)胞（?CD11b+）±LXR抑制劑GSK2033（LXRi）。(I)中的未處理（無處理）對(duì)照組數(shù)據(jù)取自（H）。統(tǒng)計(jì)方法：Fisher精確檢驗(yàn)與Benjamini-Hochberg方法結(jié)合用于多重假設(shè)檢驗(yàn)校正（B），兩因素ANOVA與Sídák校正用于多重比較（E和G-I），或混合效應(yīng)分析配合Tukey校正用于多重比較（F）。數(shù)據(jù)表示為平均值+SEM（E-I）

Para_01

1. 巨噬細(xì)胞主要運(yùn)輸膽固醇的酯化形式，這促使我們追蹤膽固醇/膽固醇酯在類似間充質(zhì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的整合，使用帶有可點(diǎn)擊手柄的膽固醇酯，這種手柄要么位于膽固醇組分上，要么位于脂肪酸鏈上。值得注意的是，膽固醇早期就定位在類似脂質(zhì)滴的結(jié)構(gòu)中，除了在24小時(shí)后明顯整合到膜狀結(jié)構(gòu)中外（圖S8C）。與之不同的是，脂肪酸最初彌漫分布，這表明它們整合進(jìn)入了細(xì)胞質(zhì)，而隨著時(shí)間的推移，脂肪酸在脂質(zhì)滴中積累（圖S8C）。另外，我們使用均勻標(biāo)記的油酸（U13C-FA18:1）作為膽固醇油酸酯（CE13C-FA）中脂肪酸組的碳追蹤劑，結(jié)果表明U13C-FA18:1在類似間充質(zhì)癌細(xì)胞中整合后大部分未發(fā)生代謝，既沒有延長也沒有縮短（圖6F）。油?；嵬。–AR 18:1）的微標(biāo)記，這是將U13C-FA18:1導(dǎo)向線粒體代謝所必需的中間體，以及三羧酸循環(huán)中間體檸檬酸、蘋果酸和天冬氨酸的未檢測標(biāo)記，表明CE衍生的脂肪酸并未整合進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行脂肪酸氧化或能量生產(chǎn)（圖6F）。相反，代謝的CE13C-FA衍生的脂肪酸被整合進(jìn)入磷脂（主要是磷脂酰膽堿[PCs]）（圖6G），這表明它們作為細(xì)胞膜構(gòu)建塊的角色，與基于點(diǎn)擊化學(xué)的免疫熒光染色結(jié)果一致（圖S8C）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，通過代謝髓鞘，LLMs不僅保護(hù)癌細(xì)胞免受脂毒性，而且還積極為它們提供髓鞘衍生的甾醇和脂肪酸，這些物質(zhì)要么被儲(chǔ)存，要么作為細(xì)胞膜生物合成的構(gòu)建塊被使用。

Para_02

1. 我們接下來研究了LLM將髓鞘來源的脂質(zhì)直接轉(zhuǎn)移給膠質(zhì)母細(xì)胞瘤MES樣細(xì)胞的功能后果。
2. 在共培養(yǎng)中，負(fù)載髓鞘的BMDMs以細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的方式增強(qiáng)了MES樣細(xì)胞的增殖（圖6H和S8D）。
3. 細(xì)胞-細(xì)胞接觸的需求進(jìn)一步得到了電子顯微鏡成像的支持，揭示了BMDMs與MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞之間的緊密相互作用，以及兩種細(xì)胞類型之間包被囊泡的釋放/攝?。▓D6I）。
4. 這些結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞對(duì)LLM來源的髓鞘脂質(zhì)的攝取既涉及被動(dòng)機(jī)制也涉及主動(dòng)機(jī)制。
5. 實(shí)際上，通過藥物抑制脂肪受體CD36或脂肪出口蛋白ABCA1，兩者在LLM中上調(diào)（圖3I和S6I）并受LXR途徑調(diào)控，取消了LLM賦予MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的促增殖效應(yīng)（圖6J）。
6. 這些結(jié)果使用從LysM-Cre Abca1/Abcg1fl/fl小鼠中分離的BMDMs進(jìn)行了遺傳驗(yàn)證（圖S8F）。

Para_03

1. 有趣的是，抑制ABCA1或LXR可以顯著降低ex vivo腫瘤細(xì)胞活力，尤其是在脂質(zhì)自由培養(yǎng)基共培養(yǎng)的條件下，這種條件下腫瘤細(xì)胞在攝取髓鞘后依賴LLM供應(yīng)的脂質(zhì)（圖6K和S8G）。
2. 這些結(jié)果顯示，LXR和ABCA1阻斷對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制依賴于LLM和腫瘤細(xì)胞之間的脂質(zhì)交換，因?yàn)檫@些抑制劑并未阻礙脂質(zhì)豐富培養(yǎng)基或缺乏巨噬細(xì)胞時(shí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的活力。
3. 這一機(jī)制在使用LysM-Cre Abca1/Abcg1fl/fl巨噬細(xì)胞的ex vivo共培養(yǎng)中進(jìn)一步得到驗(yàn)證，證實(shí)了LLM對(duì)MES樣癌細(xì)胞增殖促進(jìn)作用依賴于Abca1/Abcg1和LXR（圖S8H和S8I）。
4. 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)揭示了LLM和MES樣腫瘤細(xì)胞之間的共生關(guān)系，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞通過促進(jìn)其脂質(zhì)攝取能力來指導(dǎo)LLM的形成。
5. 反過來，負(fù)載髓鞘的LLM通過ABCA1介導(dǎo)的膽固醇/膽固醇酯流出和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移來促進(jìn)MES樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。
6. 因此，阻止LLM向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移脂質(zhì)可以抑制LLM的促腫瘤生成作用。

LLMs predict glioblastoma survival and response to immunotherapy

LLMs 預(yù)測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生存期和對(duì)免疫治療的反應(yīng)

Para_01

1. 為了評(píng)估我們發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化潛力，我們使用癌癥基因組圖譜（TCGA）和膠質(zhì)瘤縱向分析（GLASS）聯(lián)盟數(shù)據(jù)集，研究了LLM標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值（圖1I）。
2. 我們將原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本分為LLMlow和LLMhigh組，并確定LLMhigh患者的預(yù)后明顯更差（圖7A）。
3. 如預(yù)期的那樣，包含在LLMhigh標(biāo)志物組中的大多數(shù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本被歸類為MES富集（圖7B-7E）。
4. 然而，當(dāng)從這些分析中排除MES腫瘤時(shí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的LLMhigh分類仍與生存期縮短相關(guān)（圖7F）。
5. 總的來說，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了LLM作為診斷和分類工具的潛力，最終可能適用于將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者分層為個(gè)性化治療方法的策略。

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• 圖 7.富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞預(yù)測患者的臨床結(jié)果( A )根據(jù)原發(fā)性異檸檬酸脫氫酶野生型( IDHWT )膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中低、高 LLM 標(biāo)志物富集將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者 54 , 55 分層 的 Kaplan-Meier 曲線。 ( B 和 C )盒須圖描繪了所有 IDHWT 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本的單樣本 (ss) GSEA 評(píng)分，根據(jù)它們的主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄亞型 (CL，經(jīng)典型； MES，間充質(zhì)型； PN，前神經(jīng)型) 在 ( B ) TCGA 54 和 ( C ) GLASS 數(shù)據(jù)集中進(jìn)行分類。 55 ( D 和 E )基于 ssGSEA 評(píng)分將原發(fā)性 IDHWT 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤分為低 / 高 LLM 富集評(píng)分的熱圖。 ( F )在排除間充質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的情況下，根據(jù)低、高 LLM 標(biāo)志物富集對(duì)原發(fā)性 IDHWT 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行分層的 Kaplan-Meier 曲線。 ( G )左圖：泛癌癥 TAM 分析的示意圖。 5,19,56 右圖：小提琴圖顯示了 TAMs 中 LLM 標(biāo)志物評(píng)分的平均值。 ( H )未經(jīng)治療、復(fù)發(fā)性以及新輔助抗 PD-1 治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者樣本的單細(xì)胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)集中 LLMs 的百分比。 57 ( I )在接受 ICB 治療之前，響應(yīng)者和非響應(yīng)者黑色素瘤患者中非 LLM 或 LLM TAMs 的百分比。 58 ( J )受試者工作特征曲線，比較腫瘤突變負(fù)荷、LLMs、非 LLMs 和總巨噬細(xì)胞占 CD45 +細(xì)胞的百分比預(yù)測黑色素瘤 ICB 反應(yīng)的價(jià)值。 統(tǒng)計(jì)分析： log-rank 檢驗(yàn) (A 和 F) ，Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)和成對(duì)比較的 Wilcoxon 檢驗(yàn) (B 和 C) ，單因素方差分析加 Sídák 多重比較校正 (H) ，雙尾配對(duì) t 檢驗(yàn) (I) 或不成對(duì)雙尾引導(dǎo)檢驗(yàn) (J) 。 數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM (H 和 I) 。

Para_01

1. 為了將LLMs的流行情況置于更廣泛的視角并評(píng)估這些細(xì)胞在不同癌癥類型范圍內(nèi)的意義，我們對(duì)pan-cancer骨髓細(xì)胞scRNA-seq中的LLM轉(zhuǎn)錄基因簽名表達(dá)進(jìn)行了查詢。
2. 值得注意的是，富含LLM簽名的TAMs在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌和卵巢癌患者之間的比例差異很大，而黑色素瘤患者總體上LLMs水平較低，盡管其中一部分表現(xiàn)出較高的LLM富集（圖7G）。
3. 鑒于LLMs的免疫抑制特征（圖3I和S1J），我們評(píng)估了LLM簽名是否可以預(yù)測癌癥患者針對(duì)T細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）反應(yīng)。
4. 在最近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，新輔助性抗PD-1（程序性細(xì)胞死亡蛋白1）被納入可切除的復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中，并與輔助治療相比，顯示出顯著的生存益處。
5. 我們查詢了接受此類治療的患者scRNA-seq數(shù)據(jù)集，結(jié)果顯示，新輔助性抗PD-1治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與未經(jīng)治療的或復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相比，TAM-LLMs的比例顯著降低（圖7H）。
6. 因此，我們假設(shè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)的LLMhigh轉(zhuǎn)錄簽名可能是其對(duì)抗ICB反應(yīng)差的原因，這一假設(shè)仍有待驗(yàn)證，因?yàn)樯袩o針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的已建立的ICB應(yīng)答者和非應(yīng)答者數(shù)據(jù)集。
7. 因此，我們查詢了公開可用的黑色素瘤患者免疫治療數(shù)據(jù)集，以評(píng)估LLM富集是否可以預(yù)測對(duì)ICB反應(yīng)良好的患者群體的治療效果。
8. 令人驚訝的是，LLMs的含量預(yù)測了黑色素瘤的治療反應(yīng)，而總的TAM水平則沒有（圖7I）。
9. 此外，使用LLMs作為ICB反應(yīng)的生物標(biāo)志物比總TAM含量或常用的腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB）具有更高的預(yù)測價(jià)值（圖7J）。
10. 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)支持LLMs作為一種預(yù)測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存和免疫治療反應(yīng)的細(xì)胞類型的相關(guān)性。

Discussion

Para_01

1. 組織駐留型和浸潤型巨噬細(xì)胞的多方面表型是由多種因素塑造的，包括它們所處的腫瘤微環(huán)境（TME）中的代謝景觀。
2. 在本研究中，我們不僅描述了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TME的多組學(xué)特征，還揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）與癌細(xì)胞之間的復(fù)雜代謝交互，這種交互依賴于對(duì)富含膽固醇的髓鞘碎片進(jìn)行再循環(huán)。
3. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞利用神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)功能為自己謀利，例如通過神經(jīng)元擬態(tài)。
4. 同樣，我們提出，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞劫持并加劇了巨噬細(xì)胞在發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中協(xié)調(diào)脫髓鞘和再髓鞘的能力。
5. 這是通過共謀促進(jìn)吞噬髓鞘碎片的細(xì)胞通路來實(shí)現(xiàn)的，導(dǎo)致TAMs因長期暴露于髓鞘碎片而出現(xiàn)脂質(zhì)過載。
6. 這種代謝相互作用有利于類MES膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，TAMs攝取、回收和處理髓鞘產(chǎn)生自由可用脂質(zhì)的能力為它們的存活和增殖提供了燃料。
7. 值得注意的是，這種脂質(zhì)在骨髓細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的交換已在前列腺癌和肺癌中觀察到。

Para_02

1. 鑒于循環(huán)膽固醇不能穿越血腦屏障，并且大腦環(huán)境在代謝上是自主的，我們的數(shù)據(jù)顯示類似MES的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞高度依賴局部膽固醇代謝，因此需要利用寄居細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)功能來發(fā)展成惡性腫瘤。
2. 這種代謝交互在缺氧區(qū)域尤其豐富，那里是偏好利用外源性脂質(zhì)、而不是從頭合成脂質(zhì)的類似MES的脂質(zhì)營養(yǎng)缺陷型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞優(yōu)先歸巢的地方。
3. 復(fù)雜的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境是治療抵抗的基石，最終形成一個(gè)在復(fù)發(fā)性腫瘤中，尤其是MES腫瘤，動(dòng)態(tài)適應(yīng)的腫瘤微環(huán)境。
4. 我們在這種背景下發(fā)現(xiàn)的LLMs富集提出了一個(gè)疑問，即它們是否是這種轉(zhuǎn)變的主要驅(qū)動(dòng)因素，指揮支持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療后復(fù)發(fā)的適應(yīng)性機(jī)制。

Para_03

1. LLMs表現(xiàn)出免疫抑制特征，并與對(duì)ICB的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，支持LLMs積極參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫抑制微環(huán)境的觀點(diǎn)。
2. 這些發(fā)現(xiàn)與先前在多發(fā)性硬化癥中的研究一致，顯示巨噬細(xì)胞中的髓鞘吞噬作用直接抑制T細(xì)胞增殖和神經(jīng)炎癥。
3. 然而令人驚訝的是，對(duì)LLMs進(jìn)行體內(nèi)靶向后，并未在晚期腫瘤中引起淋巴細(xì)胞的頻率發(fā)生明顯變化。
4. 考慮到脂質(zhì)在免疫激活中的作用存在爭議，仔細(xì)研究TAM介導(dǎo)的髓鞘回收對(duì)淋巴細(xì)胞功能的（間接）作用將是設(shè)計(jì)增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)的聯(lián)合治療策略的關(guān)鍵。

Para_04

1. 總之，我們對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中一種促腫瘤發(fā)生的LLM亞群進(jìn)行了深入的 功能分析，包括從研究它們的轉(zhuǎn)錄教育到染色質(zhì)改變，再到它們的重新配置的脂質(zhì)體。
2. 我們發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)負(fù)載TAMs的促腫瘤功能主要是由過量 的、TME指導(dǎo)的髓鞘碎片攝取所驅(qū)動(dòng)的。
3. LLMs在促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性中的作用發(fā)現(xiàn)，需要對(duì) TAM亞群中獲得特定促腫瘤功能的代謝共進(jìn)化過程進(jìn)行更有效的策略研究。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_05

1. 本研究確定了巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的髓鞘回收是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中其促腫瘤表型的機(jī)制之一，主要關(guān)注膽固醇和脂肪酸在這一過程中的作用。
2. 然而，髓鞘由一系列脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，這些成分也可能影響巨噬細(xì)胞的表型和功能。
3. 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)聚焦于髓鞘回收和轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制，對(duì)于定義脂質(zhì)負(fù)荷表型的其他重要調(diào)節(jié)因子將是非常重要的。
4. 另外，在體外或離體模擬巨噬細(xì)胞與類似MES的腫瘤細(xì)胞之間的代謝交叉對(duì)話，可能無法完全捕捉到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，其中多個(gè)變量，如氧氣和營養(yǎng)的可利用性，極大地影響細(xì)胞間的相互作用。

STAR★Methods

Key resources table

關(guān)鍵資源表

Resource availability

資源可用性

Lead contact

主要聯(lián)系人

Para_01

1. 進(jìn)一步的信息和資源及試劑的請(qǐng)求應(yīng)直接聯(lián)系負(fù)責(zé)人Leila Akkari（l.akkari@nki.nl），并由其負(fù)責(zé)滿足需求。

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究中使用的材料和試劑列于關(guān)鍵資源表中。
2. 本研究中或之前研究中我們實(shí)驗(yàn)室生成的試劑可應(yīng)要求提供。
3. 擴(kuò)展的圖例說明已在https://github.com/djkloosterman/Kloosterman_et_al_Cell_2024上提供。

Data and code availability

數(shù)據(jù)和代碼的可獲得性

Para_01

• 本研究中生成的數(shù)據(jù)使用小鼠參考基因組mm10進(jìn)行了比對(duì)，并存儲(chǔ)在GSE266149中。本研究中使用的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生態(tài)位和亞型元模塊基因列表可從Ivy膠質(zhì)母細(xì)胞瘤圖譜項(xiàng)目（GAP）或Neftel等人獲取（表S2）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集由麥吉爾大學(xué)的Kevin Petrecca博士友情提供。本研究中使用的公開可用的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集，包括髓系細(xì)胞圖譜、黑色素瘤治療相關(guān)數(shù)據(jù)集以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者對(duì)新輔助aPD157的反應(yīng)，可分別從GEO獲取：GSE154763、GSE120575和GSE154795。TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)從http://gdac.broadinstitute.org/獲取，使用UCSCXenaTools包。原始計(jì)數(shù)使用EdgeR進(jìn)行處理。GLASS數(shù)據(jù)集從https://www.synapse.org/#!Synapse:syn17038081/wiki/585622下載，其中選擇了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和IDH野生型患者。

• 原始的小鼠單細(xì)胞RNA測序和Visium空間轉(zhuǎn)錄組分析代碼可訪問https://github.com/djkloosterman/Kloosterman_et_al_Cell_2024獲取。

• 本文報(bào)告數(shù)據(jù)的重新分析所需的任何額外信息，可應(yīng)要求向主要聯(lián)系人索取。