Differential responses to kinase inhibition in FGFR2-addicted triple negative breast cancer cells: a quantitative phosphoproteomics study
FGFR2誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞對(duì)激酶抑制的差異反應(yīng)：磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究
期刊：Sci Rep. (IF = 4.29)?
發(fā)表單位：伯明翰大學(xué)
導(dǎo) 讀
????該項(xiàng)研究中，采用差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法來分析兩個(gè)三陰性乳腺癌細(xì)胞系中FGFR激酶抑制作用對(duì)后續(xù)激酶依賴性磷酸化事件的影響，為FGFR2激酶啟動(dòng)的信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)全面的視角，鑒定了藥物依賴性的磷酸化事件，揭示了不同細(xì)胞系之間反應(yīng)的共性和差異。
摘 要
成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）依賴性信號(hào)通過多種不同機(jī)制在癌癥中被激活，然而所涉及的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍不明確。本研究采用定量差異蛋白質(zhì)組學(xué)方鑒定FGF調(diào)控的兩個(gè)三陰性乳腺腫瘤細(xì)胞系MFM223和SUM52的磷酸化事件，這些細(xì)胞系表現(xiàn)出FGF受體2（FGFR2）的擴(kuò)增表達(dá)并依賴于持續(xù)的FGFR2信號(hào)傳導(dǎo)細(xì)胞活力?；虮倔w分析顯示，SUM52細(xì)胞富含與細(xì)胞代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，而MFM223細(xì)胞富含與細(xì)胞黏附和遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)。SU5402對(duì)FGFR2的抑制作用影響了這些細(xì)胞中觀察到的磷酸化蛋白質(zhì)組的很大一部分。FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑在結(jié)構(gòu)上是靈活的，因?yàn)?b>鑒定了RAF/MAPK/ERK/RSK和PI3K/AKT/PDK/mTOR/S6K途徑中對(duì)FGFR2激酶活性的抑制。觀察到磷酸化依賴性負(fù)反饋途徑的抑制作用，定義了對(duì)FGFR2抑制的內(nèi)在抗性機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于FGFR抑制劑的治療應(yīng)用具有意義，因?yàn)樗鼈冊诰哂邢嗤z傳損傷和耐藥性途徑的細(xì)胞中鑒定出共同的和發(fā)散的響應(yīng)。
前 言
????成纖維細(xì)胞生長因子（FGFs）是進(jìn)化上保守的配體家族，在發(fā)育和分化、組織再生、血管發(fā)生、細(xì)胞遷移、細(xì)胞死亡和代謝調(diào)節(jié)等許多生物過程中起重要作用。許多形式的癌癥都涉及FGF受體（FGFR）信號(hào)異常的表現(xiàn)，F(xiàn)GF的活性配體調(diào)節(jié)腫瘤/基質(zhì)細(xì)胞相互作用，如血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃避。要提高FGFR抑制劑的臨床療效，需要更多研究了解FGF途徑損傷對(duì)FGFR激酶依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的影響。
????該研究中，采用差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析FGFR激酶抑制作用對(duì)后續(xù)激酶依賴性磷酸化事件的影響。用FGF刺激兩個(gè)細(xì)胞系，并使用差異標(biāo)記SILAC質(zhì)譜技術(shù)分析處理過程中以及兩個(gè)細(xì)胞系之間蛋白豐度的差異。這種方法為FGFR2激酶啟動(dòng)的信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)全面的視角。
方 法
????在存在或不存在FGFR激酶抑制劑SU5402的情況下，F(xiàn)GF1誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞系SUM52和MFM223中FGFR2的過表達(dá)后，進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)測定。
????使用Perseus進(jìn)行生物信息學(xué)分析，Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)計(jì)算蛋白差異，DAVID用于注釋蛋白的GO功能，的KEA對(duì)包含定位良好的磷酸位的磷酸肽進(jìn)行預(yù)測的激酶基序分析。
????更詳細(xì)的材料和方法可以在在線補(bǔ)充材料中找到。
結(jié) 果
1??SUM52和MFM223細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)概況
????總共得到185655個(gè)非冗余肽段，映射到3659種蛋白質(zhì)。SUM52細(xì)胞和MFM223細(xì)胞之間923種蛋白質(zhì)的豐度顯著不同，473個(gè)蛋白的在SUM52中高表達(dá)，450個(gè)蛋白在MFM223中高表達(dá)。SUM52中FGFR2的豐度高于MFM223，并通過蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)。（蛋白譜的全局概況顯示，盡管這兩個(gè)三陰性的FGFR2過表達(dá)細(xì)胞系均顯示出對(duì)FGFR2激活的依賴，但是很明顯它們響應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)情況不同，可能會(huì)影響其對(duì)抑制劑處理的整體反應(yīng)）
????GO富集分析SUM52中高豐度的蛋白質(zhì)富集代謝過程。幾種糖酵解酶的豐度高于MFM223細(xì)胞，包括磷酸果糖激酶（PFKL）、三糖磷酸異構(gòu)酶（TPI1）、甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）、磷酸甘油酸變位酶（PGAM1）、乳酸脫氫酶B（LDHB） 和6-磷酸葡萄糖1-脫氫酶（G6PD），表明SUM52細(xì)胞更依賴于代謝重編程來維持生存。MFM223細(xì)胞中高豐度的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞間粘附、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和肌動(dòng)蛋白依賴性過程的蛋白質(zhì)富集。許多這些增加的表達(dá)與增加的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，癌細(xì)胞的侵入和不良預(yù)后相關(guān)（兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行比較）。
2??SUM52和MFM223的磷酸化蛋白質(zhì)組分析
????總共分析了79個(gè)肽級(jí)分，得到1929個(gè)獨(dú)特的磷酸位點(diǎn)，映射到1130個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)上。SUM52細(xì)胞和MFM223細(xì)胞之間549種磷酸肽的豐度存在顯著差異，396種在SUM52中更高，153種在MFM223中更高。（類似地，首先描述磷酸化蛋白質(zhì)組全局概況，并在下文列舉代表性的磷酸化位點(diǎn)比較兩組細(xì)胞系的特征）
????FGFR2激活環(huán)酪氨酸Y656和Y657，這些位點(diǎn)上的FGFR2自磷酸化在SUM52中遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了相對(duì)蛋白水平，表明SUM52中FGFR2過表達(dá)與自磷酸化能力增強(qiáng)有關(guān)。
????MFM223中顯著更高的雙磷酸化肽是JunB磷酸肽T255S259。JunB上的T255和S259都是E3泛素連接酶SCFFBXW7識(shí)別的磷酸基序的一部分，JunB的泛素化導(dǎo)致蛋白酶體降解和JunB調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性的下調(diào)。因此，低的SUM52/MFM223比表明JunB在SUM52中比MFM223細(xì)胞更穩(wěn)定（討論JunB蛋白）。
????PIN4_Y122是SUM52中豐度明顯高于MFM223的單磷酸化肽，其通過調(diào)節(jié)線粒體代謝與腫瘤存活相關(guān)聯(lián)。在SUM52中比MFM223具有更高豐度的另一種磷酸肽是BAD_S99，可通過阻止BAD和抗凋亡BCL2蛋白之間的促凋亡相互作用來抑制凋亡，這可能表明控制細(xì)胞系之間凋亡的不同機(jī)制。（討論P(yáng)IN4，BAD蛋白）
3??磷酸化蛋白質(zhì)組分析細(xì)胞對(duì)FGFR激酶抑制劑治療的敏感性
????FGFR激酶抑制劑對(duì)FGFR2擴(kuò)增的乳腺癌患者具有潛在治療價(jià)值，但抑制作用的下游反應(yīng)是未知的。FGFR抑制劑SU5402處理后MFM223和SUM52后，分析蛋白磷酸質(zhì)譜?？偣苍?649個(gè)蛋白質(zhì)上產(chǎn)生6574個(gè)獨(dú)特的高可信度磷酸位點(diǎn)，以及SUM52中3082個(gè)磷酸肽和MFM223中2493個(gè)磷酸肽的定量數(shù)據(jù)。
????SU5402處理導(dǎo)致SUM52中的197個(gè)磷酸肽的豐度顯著降低，21個(gè)上升；MFM223中157個(gè)降低，21個(gè)上升。兩細(xì)胞系都存在大量對(duì)SU5402敏感的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化事件，表明絲氨酸/蘇氨酸定向的激酶或磷酸酶傳播了酪氨酸定向FGFR2激酶的下游事件。SUM52中共有218個(gè)磷酸化位點(diǎn)對(duì)SU5402敏感，在MFM223中有178個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中55個(gè)的磷酸酶在兩種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出相同的SU5402敏感性。兩細(xì)胞系對(duì)SU5402敏感的磷酸化位點(diǎn)的差異突出顯示了對(duì)FGFR2抑制的差異反應(yīng)。
4??基因本體和激酶富集分析（KEA）
????分析了含有SU5402敏感磷酸位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的功能，深入了解受FGFR2活性抑制作用的過程。采用了激酶富集分析（KEA），鑒定具有高活性的激酶。MFM223在MAP3K8（COT）和MAP2K1（MEK1）中得分最高，而SUM52在MTOR和SGK1方面得分最高。生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明，兩種細(xì)胞系均表現(xiàn)出不同的對(duì)SU5402反應(yīng)的激酶活性庫。（找到激酶與底物的關(guān)系，這里是簡單討論，沒有較深的通路）
5??FGFR途徑分析
????從數(shù)據(jù)中提取先前鑒定為與FGFR信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白質(zhì)中的亞磷酸酯，以了解單個(gè)成分水平上的FGFR途徑活性。使用iPTMnet數(shù)據(jù)資源分析了這些蛋白質(zhì)上的單個(gè)磷酸位點(diǎn)，該數(shù)據(jù)源整合了文獻(xiàn)匯編的激酶/底物磷酸化事件，并從功能未知的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)篩選中鑒定了磷酸位點(diǎn)。
????在后續(xù)的篇幅中，作者列舉了大量的代表性磷酸位點(diǎn)，闡述其表達(dá)特征、磷酸化特征以及功能的關(guān)聯(lián)。詳見原文，此處略。
6??共有磷酸位的差異磷酸化
????作者還創(chuàng)建了在兩個(gè)細(xì)胞系中均鑒定出的1385個(gè)磷酸位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫，并檢查了兩個(gè)細(xì)胞系之間的SILAC比值的差異，觀察到SU5402在SUM52和MFM223中差異性地改變了特定的mTOR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和RAS/MEK/ERK事件。通過觀察FGFR2誘導(dǎo)的SUM52和MFM223表型以及對(duì)SU5402的凋亡誘導(dǎo)作用，顯示SU5402介導(dǎo)的凋亡涉及同時(shí)激活促凋亡和抑制抗凋亡功能。
討 論
????這項(xiàng)研究著手確定受FGFR2激酶藥理作用影響的蛋白質(zhì)組學(xué)格局和磷酸化依賴性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。它著重于兩個(gè)三陰性乳腺腫瘤細(xì)胞系MFM223和SUM52，它們具有FGFR2基因和蛋白質(zhì)高表達(dá)的共同特性，持續(xù)依賴FGFR2信號(hào)來維持細(xì)胞存活。目的是更好地理解癌癥中對(duì)FGFR2活化的分子反應(yīng)，并確定新的生物標(biāo)記物和靶標(biāo)，以更有效地利用針對(duì)抑制FGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物。使用差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在219種對(duì)FGFR2激酶活性抑制敏感的蛋白質(zhì)上確定了341個(gè)位點(diǎn)。數(shù)據(jù)擴(kuò)展了FGFR2信號(hào)傳導(dǎo)的已知領(lǐng)域并確定許多新目標(biāo)，并觀察到RAF/MEK/ERK/RSK、PI3K/AKT/PDK/mTOR/S6K途徑受到抑制。通過專注于在兩個(gè)細(xì)胞系中確定的磷酸化位點(diǎn)，還觀察到在兩個(gè)細(xì)胞系中對(duì)FGFR2抑制的響應(yīng)存在顯著差異。這些不是互斥的，因?yàn)樵趦煞N細(xì)胞系中兩種途徑的蛋白均被抑制。結(jié)論表明，F(xiàn)GF途徑是一個(gè)動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，其行為由途徑結(jié)構(gòu)的定量和定性特征定義。此外，數(shù)據(jù)還提供了一個(gè)功能性磷蛋白生物標(biāo)志物目錄助于進(jìn)一步分析和腫瘤分級(jí)。
點(diǎn)評(píng)：該文討論了兩個(gè)細(xì)胞系的蛋白組，磷酸化組實(shí)驗(yàn)。主要關(guān)注差異位點(diǎn)，差異蛋白的功能功能，重點(diǎn)差異蛋白涉及的功能。仍然是泛泛而談，未能聚焦到特定的信號(hào)軸上。也沒有找出某個(gè)新穎特定的蛋白磷酸化靶標(biāo)位點(diǎn)。
????本文研究的是乳腺癌，乳腺癌有大量的公共數(shù)據(jù)，包括基因組，蛋白組，轉(zhuǎn)錄組，代謝等，如果可以進(jìn)行比較分析，找出乳腺癌中的共性特性，突出FGFR2過表達(dá)后特有的變化，揭示一些規(guī)律，文章可以增色不少。
