Nat Biomed Eng | PD-L1和CD3ε雙特異性抗體重新活化腫瘤特異性CD8 T細(xì)胞

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撰文：huacishu

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1、作者構(gòu)建了靶向免疫檢驗點PD-L1?和CD3ε的雙特異性抗體（PD-L1xCD3）；

2、該研究表明，靶向CD3ε和樹突狀細(xì)胞上的免疫檢驗點PD-L1的雙特異性抗體，能夠重新活化腫瘤特異性CD8 T細(xì)胞，誘導(dǎo)持續(xù)性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心傅陽心教授團(tuán)隊在國際知名期刊Nat Biomed Eng在線發(fā)表題為“Rejuvenation of tumour-specific T cells through bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells”的論文。雙特異性T細(xì)胞銜接器（BiTEs）優(yōu)先以腫瘤相關(guān)抗原為靶點，并刺激CD3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，用于治療急性B細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病。然而，實體腫瘤BiTEs的效力受到其短半衰期和在相關(guān)治療劑量下的嚴(yán)重毒性的限制。在此，作者報告了同時針對小鼠T細(xì)胞受體CD3ε和小鼠免疫檢查點程序性死亡配體1（PD-L1）的雙特異性抗體的設(shè)計和體內(nèi)性能。在多個基因腫瘤模型中，雙特異性抗體產(chǎn)生的抗腫瘤免疫應(yīng)答高于靶向腫瘤相關(guān)抗原和CD3ε的傳統(tǒng)BiTEs。作者發(fā)現(xiàn)持久的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)是CD8 T細(xì)胞再生的結(jié)果，這是由于PD-L1對樹突狀細(xì)胞的阻斷以及B7-1和B7-2（樹突狀細(xì)胞上的外周膜蛋白）的共同刺激。以樹突狀細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞為靶點的雙特異性T細(xì)胞銜接器可能是T細(xì)胞再生用于持久癌癥免疫治療的一般方法。

為了評估PD-L1靶向T細(xì)胞銜接器的抗腫瘤效果，作者制備了兩種不同的雙特異性抗體。一個靶向EGFR和小鼠CD3ε，而另一個靶向PD-L1和小鼠CD3ε。兩種抗體都由兩個單鏈可變片段和一個延長體內(nèi)蛋白質(zhì)半衰期的人類IgG的Fc結(jié)構(gòu)域組成。抗體的CH3結(jié)構(gòu)域形成異二聚體，CH2結(jié)構(gòu)域通過“LALA-PG”突變體減少Fcγ受體（FcγR）結(jié)合（圖1a）。首先通過凝膠電泳確認(rèn)了雙特異性抗體的純度和分子量。然后，使用色譜法確認(rèn)純化蛋白中的聚集物和片段少于0.5%，內(nèi)毒素水平低于0.02EUml?1.為了比較每種雙特異性抗體的結(jié)合親和力和治療效果，從小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞系MC38中獲得了一個靶細(xì)胞系。該細(xì)胞系被稱為MC38E5，表達(dá)一種嵌合的小鼠EGFR，該小鼠EGFR含有六種氨基酸，經(jīng)突變后可與EGFR抗體西妥昔單抗結(jié)合。PD-L1-靶向BsAb（PD-L1×CD3）可特異性結(jié)合PD-L1+腫瘤細(xì)胞，而EGFR-靶向BsAb（Erb×CD3）優(yōu)先結(jié)合EGFR+腫瘤細(xì)胞（圖1b）。此外，這兩種抗體在CD8 T細(xì)胞上與CD3ε具有相似的親和力（圖1b）。Fc結(jié)構(gòu)域在雙特異性抗體功能中起多種作用。一方面，它延長了體內(nèi)半衰期；另一方面，它也非特異性地連接CD3復(fù)合體。作者觀察到抗體依賴性細(xì)胞毒性也降低而不是增加脾臟中的T細(xì)胞百分比。因此，重新設(shè)計了Fc結(jié)構(gòu)域，以保持新生兒Fc受體結(jié)合親和力，但降低FcγR結(jié)合親和力。具有野生型CH2結(jié)構(gòu)域的抗體可與FcγR+小鼠巨噬細(xì)胞系結(jié)合。相比之下，具有該重組突變體CH2結(jié)構(gòu)域的抗體表現(xiàn)出降低的結(jié)合親和力，這類似于使用抗CD16/CD32阻斷FcγR結(jié)合（圖1c）。接下來測試了雙特異性抗體是否能激活T細(xì)胞以殺死腫瘤細(xì)胞。當(dāng)抗體應(yīng)用于共同培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞時，T細(xì)胞迅速上調(diào)細(xì)胞表面CD25和CD69的表達(dá)，并以劑量依賴性方式增加IFN-γ的分泌（圖1d，e）。同時，腫瘤細(xì)胞也被有效地殺死，表明T細(xì)胞功能完全激活（圖1f）。與Erb×CD3相比，盡管Erb×CD3和PD-L1×CD3在T細(xì)胞活化標(biāo)記物中具有相似的最大有效濃度（EC50）和在腫瘤細(xì)胞中具有相似的最大抑制濃度（IC50），PD-L1×CD3對IFN-γ的殺傷作用更強(qiáng)。此外，當(dāng)PD-L1在腫瘤細(xì)胞上被敲除時，PD-L1×CD3完全失去激活T細(xì)胞的能力（圖1g，h）。這些結(jié)果表明，PD-L1×CD3在體外能夠激活T細(xì)胞，以PD-L1依賴的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。

由于PD-L1×CD3在體外產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用，接下來研究它是否也能在基因小鼠模型中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。當(dāng)PD-L1×CD3經(jīng)腹腔注射給MC38荷瘤小鼠時，腫瘤在第二次輸注后被完全根除。盡管抗CD3對CD3信號的非特異性參與在早期顯示出與PD-L1×CD3相似的抗腫瘤作用，但經(jīng)治療的腫瘤在第二次輸注后最終復(fù)發(fā)。與PD-L1×CD3相比，抗PD-L1或抗PD-L1+抗CD3聯(lián)合治療均不能產(chǎn)生類似的抗腫瘤效果，表明PD-L1×CD3的抗腫瘤效果不是由于同時刺激CD3信號和阻斷檢查點的協(xié)同效應(yīng)（圖2a）。此外，與聯(lián)合治療相比，PD-L1×CD3治療顯著提高了總生存率（圖2b）。更重要的是，PD-L1×CD3治療也在MC38OVA荷瘤小鼠的脾臟中誘導(dǎo)了OT-I特異性IFN-γ產(chǎn)生，進(jìn)一步證明了抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的有效產(chǎn)生（圖2c，d）。記憶性T細(xì)胞反應(yīng)在建立針對癌癥的保護(hù)性免疫中起著關(guān)鍵作用，但BiTEs誘導(dǎo)免疫記憶的能力尚未在體內(nèi)得到證實。然而，在治療后第50天再次挑戰(zhàn)PD-L1×CD3治愈的小鼠，使其腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加10倍時，沒有腫瘤能夠生長出來，這表明PD-L1×CD3治療在根除腫瘤后有效地產(chǎn)生記憶免疫反應(yīng)（圖2e）。為了進(jìn)一步證明PD-L1×CD3治療產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞，將治愈小鼠的脾細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至Rag1?/?老鼠。轉(zhuǎn)移的脾細(xì)胞不僅阻止了腫瘤的發(fā)生（圖2f），而且在體內(nèi)有效地排斥了已建立的腫瘤（圖2g）。綜上所述，PD-L1×CD3可能向T細(xì)胞提供不同的信號，引發(fā)針對腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。

接下來，研究了PD-L1×CD3治療效果的潛在機(jī)制。PD-L1×CD3對攜帶MC38的Rag1–/–小鼠沒有影響，這證實了適應(yīng)性免疫對于PD-L1×CD3的治療效果至關(guān)重要（圖3a）。此外，用抗CD4或抗CD8消耗不同的T細(xì)胞亞群證實了CD8 T細(xì)胞，而不是CD4 T細(xì)胞，有助于治療效果（圖3b）。為了進(jìn)一步確定PD-L1×CD3治療是否依賴于腫瘤微環(huán)境中預(yù)先存在的T細(xì)胞或外周組織中T細(xì)胞的募集，在PD-L1×CD3治療期間使用FTY720（S1P受體激動劑）阻斷T細(xì)胞向腫瘤組織的轉(zhuǎn)運。FTY720阻斷不會影響PD-L1×CD3的治療效果，表明TME中預(yù)先存在的CD8 T細(xì)胞在該治療中的作用足夠大（圖3c）。為了進(jìn)一步闡明PD-L1×CD3是否靶向腫瘤組織以誘導(dǎo)抗腫瘤作用，用BsAb對小鼠進(jìn)行腫瘤內(nèi)治療。正如預(yù)期的那樣，與全身治療相比，局部治療也足以達(dá)到類似的抗腫瘤效果。作者還測試了治療后不同時間點雙特異性抗體的體內(nèi)分布。從腹腔注射后24小時開始，抗體優(yōu)先在腫瘤組織中富集，可檢測水平持續(xù)5天。因此，PD-L1×CD3可以靶向腫瘤組織以恢復(fù)CD8 T細(xì)胞免疫。除了CD8 T細(xì)胞外，許多其他類型的免疫細(xì)胞在TME中富集以響應(yīng)治療。盡管它們不是腫瘤殺傷的主要效應(yīng)細(xì)胞，但它們?nèi)钥赡芡ㄟ^與CD8 T細(xì)胞相互作用發(fā)揮重要作用。為了確定治療期間有助于抗腫瘤作用的關(guān)鍵成分，進(jìn)行了一系列消耗實驗?？筃K1.1的NK細(xì)胞耗竭或抗CSF1R的巨噬細(xì)胞耗竭不影響PD-L1×CD3對腫瘤生長的控制（圖3d）。由于PD-L1×CD3與Erb×CD3相比的獨特性主要通過參與CD3復(fù)合物結(jié)合的靶點（PD-L1與EGFR）存在，作者提出腫瘤微環(huán)境中的PD-L1+細(xì)胞可能有助于CD8依賴性抗腫瘤免疫。

PD-L1在多種組織中廣泛表達(dá)，包括淋巴細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。為了闡明PD-L1對不同細(xì)胞在PD-L1×CD3治療中的作用，作者進(jìn)行了多基因敲除（KO）研究。首先測試了PD-L1×CD3對PD-L1 KO腫瘤的治療效果。令人驚訝的是，PD-L1×CD3在患有PD-L1 KO MC38（圖4a）或B16（圖4a）腫瘤的小鼠中仍然產(chǎn)生有效的抗腫瘤反應(yīng)。然而，其治療效果在攜帶WT MC38的PD-L1缺陷小鼠中被完全消除，這表明PD-L1對宿主細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞在PD-L1×CD3的抗腫瘤作用中起著關(guān)鍵作用（圖4b）。由于骨髓細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中PD-L1+的主要宿主細(xì)胞，接下來使用條件KO小鼠研究哪些PD-L1表達(dá)細(xì)胞對PD-L1×CD3的抗腫瘤作用至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，PD-L1×CD3能夠控制Lyz2CrePD-L1f/f小鼠（巨噬細(xì)胞特異性PD-L1基因敲除）的腫瘤生長，但在Zbtb46CrePD-L1f/f小鼠（樹突狀細(xì)胞特異性PD-L1基因敲除）中不能。這表明PD-L1×CD3治療需要樹突狀細(xì)胞上的PD-L1，而不是巨噬細(xì)胞上的PD-L1（圖4c）。作者測量了PD-L1在腫瘤不同細(xì)胞上的表達(dá)水平。DC，尤其是CD103+DC，在體內(nèi)表達(dá)最高水平的PD-L1，這可能有助于PD-L1×CD3的DC靶向性。這些結(jié)果表明，作者的治療可能通過DC的獨特子集改善CD8 T細(xì)胞功能（圖4d）。綜上所述，CD103+cDC1上的PD-L1在促進(jìn)PD-L1×CD3治療的抗腫瘤效果方面起著關(guān)鍵作用。

與Erb×CD3相比，PD-L1×CD3靶向DC上的PD-L1以促進(jìn)更好的免疫反應(yīng)，因此進(jìn)一步研究了TME如何重塑以促進(jìn)CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。在治療后48小時，通過流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟和腫瘤中的淋巴細(xì)胞和髓樣細(xì)胞群。在PD-L1×CD3治療組中，腫瘤中CD8 T細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和NKT細(xì)胞的百分比顯著增加，但在Erb×CD3治療組中沒有增加。相反，NK細(xì)胞和B細(xì)胞的百分比保持不變。進(jìn)一步分析了腫瘤中CD8 T細(xì)胞的免疫表型，因為它們在治療過程中起著至關(guān)重要的作用。PD-L1×CD3處理不僅增加了CD69，還增加了CD8 T細(xì)胞上Ki-67的表達(dá)，表明CD8 T細(xì)胞在處理后被激活和擴(kuò)增（圖5a）。治療后，PD-1和TIM-3雙陽性終末衰竭CD8 T細(xì)胞的百分比顯著降低（圖5a）。同時，TCF1+和CD28+干細(xì)胞樣CD8 T細(xì)胞的百分比增加（圖5b），表明PD-L1×CD3治療改變了腫瘤內(nèi)CD8 T細(xì)胞的表型。更重要的是，PD-L1×CD3治療后，腫瘤中抗原特異性CD8 T細(xì)胞的百分比也增加（圖5b）。因此，PD-L1×CD3可能優(yōu)先激活CD8 T細(xì)胞的“DC相互作用”群體，以建立特異性抗腫瘤免疫。此外，還檢測了TME中髓樣細(xì)胞的動力學(xué)。巨噬細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的百分比在治療后顯著降低，因為它們被視為“PD-L1+靶點”（圖5c）。同時，盡管樹突狀細(xì)胞在啟動抗腫瘤作用中起著關(guān)鍵作用，但樹突狀細(xì)胞的百分比也降低了（圖5c）。值得注意的是，盡管總CD4 T細(xì)胞百分比增加，但Treg的百分比也降低。盡管其機(jī)制尚不清楚，但已有報道PD-L1在Tregs上的表達(dá)，這可能是這種現(xiàn)象的一種解釋。當(dāng)觀察到腫瘤組織中髓細(xì)胞百分比顯著降低時，進(jìn)一步研究了這些變化對免疫反應(yīng)的影響。首先，治療后淋巴結(jié)和脾臟中巨噬細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的百分比保持不變（圖5c）。其次，進(jìn)行了調(diào)查使用PD-L1基因敲除小鼠，腫瘤組織中髓樣細(xì)胞的動態(tài)變化如何調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫。當(dāng)從巨噬細(xì)胞中敲除PD-L1時，PD-L1×CD3仍能產(chǎn)生有效的抗腫瘤反應(yīng)（圖4c）。然而，巨噬細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的百分比保持不變。巨噬細(xì)胞的減少可能有助于啟動T細(xì)胞活化，但這還不夠，因為PD-L1×CD3治療也降低了Zbtb46CrePD-L1f/f小鼠中巨噬細(xì)胞的百分比，但未觀察到抗腫瘤作用（圖4c）?？傊?，PD-L1×CD3重塑TME以激發(fā)特異性抗腫瘤免疫。

產(chǎn)生保護(hù)性T細(xì)胞免疫是癌癥免疫治療中最理想的目標(biāo)之一。然而它仍然是當(dāng)前腫瘤細(xì)胞靶向治療的主要障礙。數(shù)據(jù)表明，PD-L1×CD3可以靶向DC以促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞免疫。因此，進(jìn)一步研究了參與這一過程的潛在機(jī)制。先前的研究表明，抗PD-1治療的療效依賴于CD28，這突出了共刺激信號在產(chǎn)生和維持T細(xì)胞免疫中的重要性。因此，假設(shè)PD-L1×CD3的治療效果可能依賴于T細(xì)胞的共同刺激。為了驗證這一假設(shè)，將抗CD80/86抗體與PD-L1×CD3治療相結(jié)合（圖6a）。阻斷B7-CD28共刺激完全消除了PD-L1×CD3的治療效果（圖6a）。當(dāng)使用CTLA4-Ig（一種競爭性結(jié)合CD80/86以阻斷其信號傳導(dǎo)的融合蛋白）時，也觀察到類似的結(jié)果。阻斷B7-CD28相互作用也抑制了腫瘤中抗原特異性T細(xì)胞的生成（圖6a）。為了進(jìn)一步確定共刺激信號如何幫助DC在PD-L1×CD3存在的情況下產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞反應(yīng)，在Erb×CD3或PD-L1×CD3存在的情況下，將腫瘤細(xì)胞或脾臟DC與CD8 T細(xì)胞共同培養(yǎng)。PD-L1×CD3，而不是Erb×CD3，在腫瘤-T細(xì)胞和DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中誘導(dǎo)T細(xì)胞上CD25+CD69+和IFN-γ的表達(dá)水平相似（圖6b，c）。然而令人驚訝的是，腫瘤-T細(xì)胞組的活T細(xì)胞百分比遠(yuǎn)低于DC-T細(xì)胞組。AICD發(fā)生在經(jīng)Erb×CD3或PD-L1×CD3處理的腫瘤細(xì)胞活化T細(xì)胞中，但在經(jīng)PD-L1×CD3處理的樹突狀細(xì)胞活化T細(xì)胞中顯著減少（圖6d）。因此，靶向腫瘤細(xì)胞以重新激活T細(xì)胞可能僅具有短暫的抗腫瘤作用，并且由于缺乏共刺激、T細(xì)胞死亡增加和無記憶反應(yīng)而不能產(chǎn)生持久的作用。體內(nèi)數(shù)據(jù)還顯示，與對照組相比，Erb×CD3治療組腫瘤內(nèi)CD8 T細(xì)胞的頻率較低，這與體外結(jié)果一致。此外，當(dāng)在DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)物中與PD-L1×CD3一起施用抗CD80/86阻斷抗體時，T細(xì)胞活化降低，T細(xì)胞凋亡增加至與腫瘤-T細(xì)胞共培養(yǎng)物相似的水平（圖6b，d）。這進(jìn)一步證實PD-L1×CD3治療通過增強(qiáng)CD28共刺激促進(jìn)T細(xì)胞存活。當(dāng)通過流式細(xì)胞儀檢測上清液中的細(xì)胞因子時，觀察到DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)最高水平的IL-2。然而，在Erb×CD3組中未檢測到IL-2。正如預(yù)期的那樣，IL-2的產(chǎn)生也依賴于B7-CD28（圖6e）。最后，當(dāng)分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫時，具有高水平CD28表達(dá)但不具有CD8 T細(xì)胞浸潤的患者具有更好的累積生存率（圖6f，g）。樹突狀細(xì)胞浸潤和CD80/86表達(dá)水平與CD28水平顯著相關(guān)，表明樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞共刺激在抗腫瘤免疫中的潛在重要性?？傊琍D-L1×CD3靶向樹突狀細(xì)胞，以B7-CD28依賴的方式激活抗原特異性T細(xì)胞，并克服了傳統(tǒng)療法的主要障礙（圖7）。

雙特異性T細(xì)胞接合器在實體腫瘤中的應(yīng)用可能不僅受到免疫抑制性TME的阻礙，而且還受到缺乏合適靶點的限制。在此，設(shè)計并評估了PD-L1靶向雙特異性抗體在基因小鼠模型中的有效性和安全性。與傳統(tǒng)的治療相比，PD-L1×CD3治療靶向并重新激活體內(nèi)已有的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL），這可以充分根除腫瘤并建立保護(hù)性免疫。從機(jī)制上講，用PD-L1×CD3靶向樹突狀細(xì)胞亞群而不是腫瘤細(xì)胞不僅可以增強(qiáng)B7-CD28相互作用，而且可以同時阻斷PD-1/PD-L1檢查點，以建立適當(dāng)?shù)目乖禺愋訡D8 T細(xì)胞反應(yīng)來控制腫瘤進(jìn)展。綜上所述，研究強(qiáng)調(diào)了Batf3+DC代替腫瘤細(xì)胞在PD-L1靶向雙特異性抗體治療中不可或缺的作用，從而恢復(fù)和維持對癌癥的持久免疫應(yīng)答。

教授介紹

傅陽心教授在中國上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)，并獲得博士學(xué)位，2015年就職于德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心病理區(qū)，他的研究領(lǐng)域主要是癌癥的免疫治療，他發(fā)現(xiàn)60%的病例免疫治療失敗是因為腫瘤內(nèi)部沒有足夠的免疫細(xì)胞。免疫療法可以加速免疫系統(tǒng)，但殺傷細(xì)胞仍然無法進(jìn)入腫瘤內(nèi)部對癌癥造成傷害。傅博士的團(tuán)隊一直在開發(fā)新的方法，通過使用一種生物學(xué)上的誘餌，將T細(xì)胞引導(dǎo)到它們需要去的地方。一旦T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤內(nèi)，免疫治療應(yīng)該能夠?qū)λ蓄愋偷陌┌Y更有效。并且傅陽心教授以通訊作者在國際權(quán)威期刊上發(fā)表論文多篇。

參考文獻(xiàn)

Liu L, Chen J, Bae J, et al. Rejuvenation of tumour-specific T cellsthrough bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells. Nat BiomedEng. 2021;10.1038/s41551-021-00800-2. doi:10.1038/s41551-021-00800-2